%A 张潇筠, 徐坤, 沈俊岑, 穆璐, 钱泓润, 崔婕妤, 马宝霞, 陈知龙, 张智英, 魏泽辉 %T 一种新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统 %0 Journal Article %D 2022 %J 遗传 %R 10.16288/j.yczz.22-118 %P 708-719 %V 44 %N 8 %U {http://www.chinagene.cn/CN/abstract/article_5927.shtml} %8 2022-08-20 %X

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)同源指导修复(homology-directed repair, HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD 供体适配基因编辑系统(donor adapting system, DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain, Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence, Gal4BS)作为受体序列与双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。