STEME系统：一种助力体内定向进化的新工具

胡风越, 王克剑

The STEME system: a novel tool for directed evolution in vivo

Hu Fengyue, Wang Kejian

表1 部分植物定向进化突变文库构建方法的介绍与比较

Table 1 Introduction and comparison of partial methods for mutant library construction of directed evolution in plants

方法 原理 变异类型 体内/体外 优点 缺点 epPCR 基于PCR技术,在PCR反应体系中添加Mg2+、Mn2+、诱变dNTP类似物[29],或使用改造的DNA聚合酶[30],从而引起碱基突变频率和种类的增加 碱基置换 体外 允许高突变率; 易于使用商业配方 氨基酸取代数目十分有限 位点饱和突变 基于PCR技术,以基因序列中特定密码子为目标,使用含有与目标位点核苷酸不匹配的引物混合物,在目标密码子上引入所有可能的密码子的氨基酸替换[31] 碱基置换 体外 精确定位特定位点,允许多个密码子同时突变,适用已知蛋白的突变 需要掌握足够的结构和生化知识; 密码子冗余增加了后续筛选的范围[26] DNA shuffling 利用酶或物理方法将一组含有益突变位点的基因随机酶切成小片段,进行无引物PCR使DNA片段重新组装,最后获得含有多种同源序列的嵌合体[32] 同源重组 体外 有效积累有益突变;可实现目的蛋白多种特性的共进化 需逐步剔除有害突变;依赖序列同源性 CDE 基于传统的CRISPR/Cas技术,设计覆盖目标基因或特定位点的sgRNAs文库,构建克隆载体,结合转化技术和组织培养,获得突变体库[5] 插入缺失 体内 原理和操作简单,可广泛运用于植物性状改良或蛋白工程 易造成不必要的蛋白功能丧失或植株死亡 STEME 基于CRISPR碱基编辑技术,设计覆盖目标基因或特定位点的sgRNAs文库,构建克隆载体,结合转化技术和组织培养,获得突变体库[7] 碱基置换 体内 产物纯度高,提升突变多样性,靶向诱变范围更广泛 编辑效率有待进一步提升