CRISPR-Cas基因编辑系统升级：聚焦Cas蛋白和PAM

唐连超, 谷峰

Next-generation CRISPR-Cas for genome editing: focusing on the Cas protein and PAM

Tang Lianchao, Gu Feng

表2 不同Cas蛋白PAM确定方法与比较

Table 2 Comparison of different PAM determination methods

方法 切割环境 筛选方向 特点 Cas蛋白 PAM 文献 生物信息学 分析 无 正向 原始信息来自于基因组中spacer,结果可靠; 需要已知的spacer; 无法确保spacer来源的正确性; 获得的PAM信息可能不全面 SpCas9 NGG [42] St1Cas9 NNAGAAW [40] St3Cas9 NGGNG [40] NmCas9 NNNNGATT [60] 体内切割反应 (PAM 质粒库) 细菌 反向 该方法的PAM覆盖度高; 需要制备深度覆盖的质粒库; 需要构建Cas蛋白稳定表达的宿主; PAM逃逸受靶序列突变或DNA修复影响 SpCas9 NGG [34,63] SpCas9 VQR NGA [34] SpCas9 EQR NGAG [34] SpCas9 VRER NGCG [34] SaCas9 NNGRRT [34] SaCas9 KKH NNNRRT [29] CasX TTCN [31] CasY.1 TA [31] St1Cas9 NNRGRA [34,64] NmCas9 NNNNGNNT [64] 体内切割反应 (crRNA 质粒库) 细菌 正向 提供了一种正向的筛选方式; 噬菌体基因组中展现出来的PAM有限; 构建向导RNA库的费用高于PAM库 FnCpf1 TTN [25] 体外切割反应 体外 正向或反向 被切割模板量大,可以覆盖更多的潜在 PAM,快速; 需要纯化蛋白、靶向模板容易降解、体外 条件可能导致PAM结果产生差异 SpCas9 NGG [25,52,53] SpCas9-NG NG [38] SaCas9 NNGRRT [25] FnCas9 NGG [62] FnCas9 RHA YG [62] CjCas9 NNNVRYM [65] St1Cas9 NNRRRA [25] NNAGAAW [53] St3Cas9 NGGNG [60] PAM-SCANR 细菌 正向 是一种正向筛选; 采用dCas蛋白,结果可能与以切割为 基础分析获得的PAM有差异; 筛选可能会受到阻遏效应波动影响; 操作相对复杂 SpCas9 NGG [54] St1Cas9 NNAGAA [54] PAM-DOSE 人类细胞 正向 能够直接在人类细胞中进行Cas蛋白 PAM的确定; 采用正向筛选方式,不用制作大容量的 PAM库; 筛选方法依赖NHEJ修复 SpCas9 NGG [55] SpCas9-NG NG [55] FnCpf1 YYN [55] LbCpf1 YYN [55] AsCpf1 YYN [55] MbCpf1 YYN [55]