串联反向CTCF位点的系列删除揭示增强子调控HOXD基因簇表达的平衡

王玲, 李金环, 黄海燕, 吴强

Serial deletions of tandem reverse CTCF sites reveal balanced HOXD regulatory landscape of enhancers

Wang Ling, Li Jinhuan, Huang Haiyan, Wu Qiang

图2 CBS e删除改变增强子与启动子间的远程互作从而影响HOXD基因簇的基因表达 A：利用CRISPR DNA片段编辑技术获得CBS e删除的单细胞克隆株(e#113和e#126)的示意图。针对CBS e设计一对sgRNA(sgRNA e1和sgRNA e2),Cas9核酸酶在sgRNA e1和sgRNA e2的介导下特异性识别CBS e两侧靶向序列后进行切割,形成的两个切口被修复后连接在一起获得CBS e删除的编辑细胞。B：采用特异性引物PCR后进行凝胶电泳实验鉴定单细胞克隆株。引物对e1F/e2R在野生型(WT)细胞中扩增出1560 bp的片段,在e#113和e#126细胞株中扩增出CBS e删除后的729 bp片段(红色虚线框指示目的条带)。C：TA克隆并进行桑格测序确定单细胞克隆株的基因型。引物对e1F/e2R在e#113和e#126细胞株中扩增的产物经TA克隆后的测序结果图。D：RNA-seq数据分析比较WT细胞、e#113和e#126细胞株中HOXD基因簇表达水平。*：P<0.05;**：P<0.01;FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped reads。E：在染色质构象捕获(QHR-4C)实验中,以增强子Island5为观测点(viewpoint,VP),分析e#113和e#126细胞株中Island5与HOXD基因簇启动子及调控元件Island2、GT2和CS38-41的远程互作。将e#113和e#126细胞株的数据分别与WT进行log2处理,红色实线框内为Island5与HOXD基因簇启动子之间的染色质相互作用,黑色虚线框依次指示调控元件Island2、GT2和CS38-41。F：以增强子GT2为VP,分析CBS e删除后GT2与HOXD基因簇启动子的远程互作。红色实线框内为GT2与HOXD基因簇启动子间的染色质相互作用放大图,黑色虚线框依次指示调控元件Island2、Island5和CS38-41。G：以HOXD9启动子为VP,分析e#113和e#126细胞株中调控元件Island2、Island5、GT2、CS38-41与HOXD9启动子之间的染色质相互作用。黑色虚线框指示Island2,红色实线框内分别为Island5、GT2和CS38-41与HOXD9启动子之间的染色质相互作用放大图。

Fig. 2 Alterations of long-distance chromatin interactions between enhancers and promoters upon CBS e deletion affect gene expression of the HOXD cluster