DOI: 10.1360/yc-007-0945

南阳牛DGAT2基因PCR-RFLP多态性及其与生长性状相关性研究

张争锋^1,4, 陈宏^1,2, 李秋玲^1,5, 雷初朝¹, 张春雷¹, 王新庄³ , 王居强³, 王轶敏³

1. 西北农林科技大学动物科技学院, 陕西省农业分子生物学重点实验室, 杨凌 712100;

2. 徐州师范大学细胞与分子生物学研究所, 徐州 221116;

3. 河南省肉牛工程技术研究中心, 郑州 450003;

4. 山东省计算中心, 济南 250014;

5. 山东省农业科学院奶牛研究中心, 济南 250100

摘要: 以131头纯种南阳牛为研究材料, 利用PCR－RFLPs对二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)基因的第6内含子和第7内含子的多态性及其与生长发育的相关性进行了分析。结果表明: 南阳牛在该位点分别检测到两种等位基因A/B和N/M, 频率分别为0.875/0.125和0.971/0.029。A和N等位基因是群体中的优势等位基因。该基因内含子6对南阳牛6月龄的体高、2岁体重、6月龄到两岁的胸围和体斜长都有显著的影响, 内含子6的AA基因型的6月龄的体高比杂合型高3.8 %, 两岁体重高3.9%, 6月龄到两岁的胸围分别高3.8%、3.4%、3.7%、4.3%; 6月龄到两岁的体斜长分别高3.8%、3.6%、3.8%、3.1%。内含子7对18月龄和两岁的坐骨端宽有极显著的影响(P<0.01); 对两岁的胸围有显著的影响(P<0.05)。

关键词: DGAT2; 南阳牛; PCR-RFLP; 生长性状

Polymorphisms of DGAT2 gene and its associations with several growth traits in Nanyang cattle

ZHANG Zheng-Feng^1,4, CHEN Hong^1,2, LI Qiu-Ling^1,5, LEI Chu-Zhao¹,

ZHANG Chun-Lei¹, WANG Xin-Zhuang³_, WANG Ju-Qiang³, WANG Yi-Min³

1. College of Animal Science and Technolog, Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agricultue, Northwest A&F University,     Yangling 712100, China;

2. Institute of Cellular and Molecular Biology, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China;

3. Research Center of Cattle Engineering Technology in Henan, Zhengzhou 450003, China;

4. Shandong Computer Science Center, Ji’nan 250014 China;

5. Dairy Cattle Rearch Center, Shandong Academy of Agricultural Science, Ji’nan 250100, China

Abstract: The associations between SNPs in intron 6 and intron 7 of the bovine diacylglycerolacyltransferase (DGAT2) gene and growth traits in purebred Nanyang cattle (n=131) were reported in this study. Alleles detected in intron 6 were allele A and B with frequencies of 0.875 and 0.125, respectively; alleles detected in intron 7 were allele N and M with frequencies of 0.968 and 0.032, respectively. The animals with genotype AA in intron 6 showed 3.8% increases in body height (P < 0.01), 3.9% increases in body weight (P < 0.05), 3.8% (P < 0.05), 3.6% (P < 0.05), 3.8% (P < 0.01) and 3.1%( P < 0.01) increase in body length at age six-month to two-year compared with genotype AB, respectively. They also showed 3.8 % (P < 0.05), 3.4 % ( P < 0.01), 3.7% (P < 0.01) and 4.3% (P < 0.01) increases in heart girth at age six-month to two-year respectively. Animals with the NM genotype show significantly higher average heart girth at age two years (P < 0.05), and Hucklebone width (P < 0.01) at age eighteen-month (P < 0.01) and two-year (P < 0.01) compared with animals with the genotype NN, respectively.

Keywords: DGAT2; Nanyang cattle; PCR-RELP; growth related traits

二酰甘油酰基转移酶2(diacylglycerolacylt-ransferase, DGAT2)和二酰甘油转酰基转移酶1 (diacylglycerolacyltransferase1, DGAT1)都是催化甘油三酸脂合成最后一步反应的酶^[1,2],也是甘油三酸酯合成过程中的唯一关键酶。DGAT2与脂肪代谢、脂类在组织中的沉积有很大关系^[3], 对肝脏新合成的脂肪酸聚集成VLDL颗粒也有重要作用^[4]。其主要作用机制为使二酰甘油(diacylgycerol, DAG)加上脂肪酸酰基形成三酰甘油(triacylgycerol, MAG)。此外, 该酶还参与肠道脂肪的吸收^[5,6], 甘油三酸酯是乳脂和体脂的主要成分。因此, 该基因可以通过调节甘油三酸酯的合成量, 影响动物脂肪的含量。

南阳牛是我国优良的地方黄牛品种, 有耐粗饲, 抗逆性好, 肉质鲜美等优点, 但是后躯不发达, 屠宰率低, 不符合肉用品种的要求。本实验利用PCR-RFLP方法首次分析南阳牛DGAT2基因第6、7内含子多态性与体重、体尺性状的关系, 探讨DGAT2基因与牛生长性状的关系, 以期能为南阳牛的标记辅助选择提供一定的理论依据。

1  材料和方法

1.1  材料

实验动物: 南阳牛131头, 其中109头为成年基础母牛, 来自河南省南阳市黄牛良种繁育场, 圈养, 饲喂条件相同, 22头基础母牛来自附近农户。静脉采血20 mL, ACD抗凝, 带回实验室, -80℃冷冻保存, 并用Chen等^[7]的方法, 提取血液基因组DNA。

1.2  实验方法

本实验采用PCR-RFLP技术, 参考徐博士论文^[8]设计的引物, 扩增DGAT2基因第6、7内含子全长, 然后分别用限制性内切酶TaqⅠ、PvuⅡ酶切, 统计分析各种基因型在南阳牛群体中的分布及其与生长性状的相关性。

1.2.1  引物

Intron 6: F 5´- AATCGCAAGGGCTTTGTGAAAC -3´,

R 5´-CCCCAGGTGTCAGAGGAGAAGA -3´;

Intron 7: F 5´- AGGCCTCTTCTCCTCTGACACCT -3´,

R 5´-GAGGCCGAACTTGGTCTTATGCT -3´。

由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2  PCR扩增体系(15 mL)

10×buffer(含Mg²⁺)1.5 mL; 2.0 mmol/L dNTP(宝生物)1.2 mL; 引物(上下游等体积混合10 pmol/μL)0.5 mL; Taq DNA 聚合酶(宝生物公司, 0.5 U/μL)1.0 mL; DNA模板50 ~100 ng; 加ddH₂O至15 mL。

1.2.3  PCR扩增程序

94 ℃预变性4 min, 94℃变性50 s,  65℃复性30 s , 72℃延伸X s, 34个循环后, 72℃延伸10 min, 4 ℃保存。其中X为: intron 6, 60 s; intron 7, 90 s。

1.2.4  酶切

取PCR扩增产物10 mL, 然后分别加入2.5 U/μL的限制性内切酶TaqⅠ、PvuⅡ1.0 mL, 酶切 buffer 1.0 mL, 加入去离子水至20 mL混匀后, intron6于65 ℃, intron7于37℃温育过夜。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测, 所用marker 为天为时代的DL2000, Kodak凝胶成像系统照相分析。

1.3  数据处理

调用SAS(SAS Institute Inc, Version8.0 Edition)软件一般线性模型GLM(general linear models procedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据Liu^[9]所述方法, 并考虑本实验的具体情况建立如下统计模型:

Y_ij = m+ age + ma +marker /age +e_ij

式中Y_ij为性状表型值, m为群体平均值, age为年龄效应, ma是年龄与基因型之间的互作效应, marker /age为年龄内基因型效应, e_ij为残差。由于来自农户的22头个体数据不全面, 没有参与显著性分析。参与分析的动物来自同一大场的5个圈舍, 草料补饲情况一致, 因此没有考虑圈舍效应。

2  结果与分析

2.1  DGAT2基因的PCR-RFLP分析

本研究中, DGAT2基因第6内含子的PCR扩增产物为1,008 bp; 第7内含子的PCR扩增产物为2,012 bp。限制性内切酶TaqⅠ在内含子6扩增产物中有两个酶切位点, 第一个酶切位点将内含子6切成980 bp和27 bp两个片段, 但是27 bp的片段在2%的琼脂糖凝胶电泳中基本看不见, 因而显示一条带。第二个酶切位点将内含子6切成385 bp、596 bp和27 bp 3个片段, 也只能显示两个片段。杂合子显示981 bp、596 bp、385 bp 3条带。我们将第一个酶切位点定义为等位基因B; 将第二个酶切位点定义为等位基因A。限制性内切酶PuvⅡ消化内含子7扩增产物后产生两个等位基因N和M。但是在南阳牛群体中, 只发现两种基因型NN和NM, 在整个群体中只发现6头个体是NM基因型, 其余的全是NN型。我们由此推测MM型个体在南阳牛群体中的频率极低。

 

图1  牛DGAT2 基因第6 内含子PCR产物TaqⅠ酶切多态性凝胶电泳检测

Fig. 1  Agarose electrophoresis detection of TaqⅠdigested product of DGAT2 gene intron 6

 

 

图2  牛DGAT2 基因第7内含子PCR产物PuvⅡ酶切多态性凝胶电泳检测

Fig. 2  Agarose electrophoresis detection of PuvⅡdigested product of DGAT2 gene intron 7

2.2  在群体中不同基因型分布的Hardy–Weinberg平衡检验

从表1可以看出, 南阳牛DGAT2基因第6内含子TaqⅠ-RFLP和第7内含子PuvⅡ位点均有两种等位基因分别是等位基因A、B和等位基因N、M, 都只有一种纯合子, 分别检测到两种基因型AA、AB和NN、NM。卡方检验结果表明该群体在这两个位点均处于Hardy-weinberg平衡状态。其中等位基因A、N分别是内含子6和内含子7的优势基因; 基因型AA和NN分别是优势基因型。

 

表1  南阳牛DGAT2基因第6内含子TaqⅠ和第7内含子PuvⅡ酶切消化的等位基因及基因型频率

Table 1  The frequency of alleles and genotypes of the TaqⅠand PuvⅡpolymorphism in intron 6 and intron 7 of DGAT2 gene in Nanyang cattle

 

表2  南阳牛不同年龄各生长发育相关性状的最小二乘均值及标准误

Table 2  The List Square Means (LSM) and Standard Error ( SE ) in different growth term of Nanyang Cattle

数值为平均数±标准误;字母相同表示差异不显著,小写字母表示差异显著,大写字母表示差异极显著(下表同)。

Data in the table are means ± standard error. Values in each line with different lower case superscripts are at P < 0.05; and with capital superscripts different at P < 0.01.

2.3  DGAT2 基因PCR-RFLPs 多态性与性状的相关性分析

我们采用SAS8.0 统计软件, 对其中记录比较全面的109头南阳牛的不同基因型个体与体尺和体

重数据进行了显著性检验, 因年龄对各项指标影响都极显著(表2), 所以我们统计分析同一年龄段的各项指标, 以剔除年龄的影响, 结果见表3。从表3可以看出南阳牛DGAT2基因第6内含子TaqⅠ-RFLP多态位点的优势基因型AA的2岁的体重、6月龄体高、6月龄到2岁的胸围和体斜长都显著地高于杂和基因型AB, 除12月龄的胸围、6月龄和12月龄的体斜长达到显著水平(P<0.05)外, 其余均达到极显著的水平(P<0.01)。第7内含子PuvⅡ多态位点的杂和基因型NM的18月龄到2岁的坐骨端宽(P<0.01), 2岁的胸围(P<0.05)都显著高于优势基因型NN。在这几项指标中, NM基因型的值均高于NN型。

 

表3  南阳牛DGAT2基因第6内含子和第7内含子各基因型对体尺和体重的影响

Table 3  Effects of different genotypes of intron 6 and intron 7 of DGAT2 gene on body weight and body measurements in Nanyang cattle

3  讨 论

DGAT2在生物体内甘油三酸合成中, 有非常重要的作用, 并且是哺乳动物维持生命所必需的^[10,11], 在肠道它可以替代DGAT1合成甘油三脂^[12,2]。Sylvaine等^[13]2001年克隆了哺乳动物第二个DGAT, DGAT2, 并通过其与Mortierella rammaniana细菌的同源性被鉴定出来, 它在昆虫细胞的表达, 可使细胞甘油三酸脂的合成水平上升到细胞膜水平的6倍。Winter等^[14]通过荧光原位杂交技术(FISH)将牛的DGAT2基因定位于BTA15q25-26。YU等^[15]研究证明DGAT2基因与瘦素基因(leptin)及胰岛素样受体底物2基因有密切的关系。Suzuki等^[16]研究也表明, 小鼠胰岛素样受体底物2(insulin receptor substate-2, IRS-2)基因敲除后, DGAT2基因表达上调, 小鼠leptin基因敲除后, 白色脂肪组织中DGAT1和DGAT2基因呈交互表达。Leptin对动物的饲料利用及正常生长有重要的作用^[17,18], Leptin基因敲除导致小鼠肥胖, 且脂肪组织的DGAT2基因表达增强。Meegalla等^[4]证明与哺乳动物的生长密切相关的胰岛素^[17]能促进DGAT2的表达。同时有研究表明, DGAT2基因与动物的体重、体尺等指标有关^[19~21]。本文证实了DGAT2基因对牛的体高、体重、胸围和体斜长有显著影响。