汉族人群具有复杂的遗传结构，不同地区人群存在一定程度的地域遗传差异，探究汉族人群的精细遗传结构，并构建高效的地域来源推断模型，对于揭示人群演化规律及实现精准祖源推断具有重要意义。然而当前针对国内汉族人群的祖源推断模型却较为缺乏。本研究旨在通过分析汉族人群高密度SNP数据，探索人群遗传结构与地理分布的关联，并基于机器学习算法构建地域来源推断模型，提升祖源推断技术对国内汉族人群的分辨力。研究选取来自中国8个省份的汉族人群全基因组SNP数据，通过连锁不平衡检验等进行质控并构建人群数据集，质控后共获得1,229份样本和208,193个SNP位点，首先应用主成分分析(principal component analysis，PCA)、ADMIXTURE聚类分析等方法进行遗传结构分析，结果表明不同地域的汉族存在一定程度的遗传结构差异，并据此将汉族人群划分为7个遗传分区。在此基础上，使用机器学习(machine learning，ML)算法，以PCA降维后主成分(principal component，PC)为输入特征，基于参考人群数据集5折交叉验证对比XGBoost(eXtreme gradient boosting)、随机森林(random forest，RF)和K近邻(K-nearest neighbors，KNN)等不同机器学习分类模型的预测性能，引入似然比(likelihood ratio，LR)方法作为评价指标，构建最优预测模型并在独立测试集中进行验证。结果表明，在参考集中，PCA-XGBoost模型预测性能最优，第1位预测准确率为87.66%，LR准确率为96.87%。在测试集中，PCA-XGBoost模型第1位预测准确率达到85%以上，LR准确率95%以上，表明该模型具有良好的泛化能力。综上，本研究开发的PCA-XGBoost预测模型兼具高效性、稳健性与高准确性，为群体遗传学及法医遗传学等相关研究提供了可靠的方法学工具。

精准识别单核苷酸分辨率下的转录因子结合位点(transcription factor binding sites, TFBSs)是解析基因表达调控网络的核心科学问题。为改进现有计算模型在跨细胞类型预测中的性能，本研究提出一种融合通道与空间注意力机制的深度学习模型。通过系统整合10个核心转录调控因子(包括CTCF、EGR1、FOXA1等)在13种典型人类细胞系(涵盖A549、GM12878、H1-hESC等)的51组染色质免疫沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)数据和13组脱氧核糖核酸酶I高敏感位点测序(deoxyribonuclease I hypersensitive site sequencing, DNase-seq)数据对模型进行训练与测试，结果表明在23个测试的TF-细胞类型中表现出优异性能，平均受试者工作特征曲线下面积(area under receiver operating characteristic curve, AUROC)达到0.986，其中91%样本的AUROC超过0.970；平均精确率-召回率曲线下面积(area under precision recall curve, AUPRC)为0.169，较随机预测基线(0.000156)提升超1,000倍。相较于FactorNet、Leopard及DeepGRN等当前领域内具有代表性的模型，本模型在9个共有的TF-细胞类型数据集上，其AUROC均值展现出优势。可视化分析表明，模型能精准识别TF在不同细胞类型中的特异性结合位点。上述结果表明，本模型为跨细胞类型的TFBSs精准预测提供了高效计算工具，有望为基因表达调控机制的深入解析及相关疾病分子机理研究提供重要支撑。

随着基因组测序技术的普及，利用基因组标记预测复杂性状已成为育种关键。然而，基因组数据高维稀疏及其内部遗传标记间复杂的非线性交互特性，极大提高了精准数据分析的难度与硬件部署成本。因此本研究提出了一种基于染色体编码的多头自注意力模型(multi-head self-attention model)——ChrFormer进行基因组预测。该模型采用染色体编码器将全基因组SNP数据压缩为20个染色体特征向量和1个全局特征向量，利用多头自注意力机制动态捕获跨染色体的长程互作效应，最终通过多层感知机(multilayer perceptron，MLP)实现从基因组特征到表型的精准预测。本研究选取4,875头大白猪50K SNP基因分型数据以及4项重要生产性状(100 kg和115 kg背膘厚、100 kg和115 kg日龄)作为研究对象，采用十折交叉验证方法，以皮尔逊相关系数作为评价指标，系统比较了ChrFormer与基因组最佳线性无偏预测(genomic best linear unbiased prediction，GBLUP)、贝叶斯方法A (BayesA)和典型深度学习方法——视觉几何组(visual geometry group，VGG)、前馈神经网络(feedforward neural network，FNN)的预测性能；并且从模型参数量、训练耗时和过拟合程度等方面分析各深度学习模型的优劣。结果显示，ChrFormer在所有测试性状上的预测精度均显著优于VGG和FNN深度学习模型。在100 kg背膘、115 kg背膘和115 kg日龄这3个性状上，其预测准确度超越了传统的GBLUP和BayesA方法。虽然ChrFormer的单次迭代训练时间较长(54.88 s)，但模型参数量仅约为VGG和FNN的1/10，且表现出更稳定的抗过拟合特性。本研究验证了自注意力机制的ChrFormer模型在猪生长性状表型的基因组预测的实用性，其轻量化的架构特点和稳定的预测性能，为计算资源有限的育种场开展表型的精准预测提供了切实可行的技术方法。

单核苷酸变异(single nucleotide variations，SNVs)是最常见的人类致病突变形式，而碱基编辑技术则为治疗这类致病性变异提供了理想的解决方案。RNA编辑技术因其作用可逆、无需永久改变基因组而规避了长期风险，且编辑器体积小巧，已成为当前基因治疗的热点。其中mini-dCas13X.1介导的RNA腺嘌呤碱基编辑(mxABE)系统展现出高效的RNA碱基编辑效率，但仍然存在旁观者编辑(bystander editing)效应导致的非靶向核苷酸编辑，构成了主要的脱靶风险。本研究通过在sgRNA序列中删除与非靶向腺苷相对的核苷酸，有效降低了mxABE系统的旁观者编辑效应。体外实验结果表明，该策略将旁观者编辑率成功控制在5%以下，并仍能维持约70%的高效目标位点编辑。在杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)小鼠模型中，通过单次单个腺病毒(adeno-associated virus，AAV)注射递送mxABE系统后，结果显示胫骨前肌观察到显著的治疗效果，并成功消除了非靶向腺苷的旁观者编辑。本研究为mxABE的RNA编辑系统治疗单基因遗传疾病治疗提供了新的精准靶向策略。

为了探索能提高犬体细胞克隆效率的新方法，本研究比较了糖酵解促进剂PS48和表观遗传修饰剂(DNA甲基化酶抑制剂RG108和组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid)的不同处理浓度和时间对犬-猪异种体细胞核移植(interspecies somatic cell nuclear transfer，iSCNT)胚胎发育效率的影响。结果显示：(1) 5 μmol/L PS48处理犬耳成纤维细胞(canine ear fibroblasts，cEFs)和犬脂肪间充质干细胞(canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，cAd-MSCs) 24 h显著增强了其后续iSCNT胚胎的发育能力，PS48处理cEFs组的iSCNT胚胎的卵裂率、4-细胞期率和8-细胞期率均显著高于对照组(46.90±1.64% vs 13.30±1.61%，32.30±1.55% vs 8.26±0.88%，10.62±1.68% vs 5.50±0.84%；P<0.05)，PS48处理cAd-MSCs组的iSCNT胚胎的卵裂率和4-细胞期率显著高于对照组(49.51±3.00% vs 31.25±2.73%，26.21±2.08% vs 15.18±1.58%；P<0.05)；(2) 20 μmol/L RG108处理cEFs和cAd-MSCs 48 h对iSCNT胚胎发育效率无显著影响，0 nmol/L、400 nmol/L、500 nmol/L和600 nmol/L Scriptaid分别处理cEFs和cAd-MSCs 24 h对iSCNT胚胎发育效率无显著影响；(3) 20 μmol/L RG108处理两种供体细胞来源iSCNT胚胎对其发育有显著促进作用(P<0.05)，500 nmol/L Scriptaid处理cEFs来源的iSCNT胚胎16 h可显著提高其卵裂率和4-细胞期率(23.08±2.94% vs 9.47±1.70%，18.68±3.25% vs 6.32±1.07%；P<0.05)。本研究建立了能显著提高犬-猪iSCNT胚胎发育效率的新方法，有助于促进犬体细胞克隆技术的应用和发展。

在法庭科学领域，犯罪现场的混合DNA证据常包含多个个体遗传信息，其准确解析是案件侦破和司法裁决的关键。随着法医遗传学技术的发展，虽检测能力有所提升，但多供者分型解析仍存在瓶颈，传统方法难以同时精准推断嫌疑人基因型及贡献比例，无法满足复杂混合样本解析的高要求。针对上述问题，本文提出基于概率残差优化的伽马分布连续模型算法，通过构建两步概率评估架构，先基于等位基因排列组合生成候选基因型组合并计算初步贡献比例，再引入伽马分布假设构建概率密度函数，动态优化形状参数α和尺度参数β以计算残差概率权重，经迭代式极大似然估计同步优化基因型组合与贡献度参数，结合群体基因频率数据库输出最大似然值解析结果。该算法可为司法鉴定提供可量化评估的可靠工具，显著提升复杂混合样本解析准确性，增强混合DNA辅助侦查效能，对推动法庭科学技术进步、保障司法公正意义重大。

随着我国转基因玉米和转基因大豆的商业化种植，为了保证我国生物育种产业的健康发展，迫切需要开发转基因玉米和大豆的现场快速检测技术。本研究针对转基因玉米和大豆现场快速检测技术的不足，提出了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)的快速检测方法。选择具有代表性的转基因玉米(双抗12-5、DBN9936、MON810)和大豆(DBN9004、GTS40-3-2、SHZD32-1)为检测对象，根据其侧翼序列，筛选特异性引物和探针，建立了高特异性、灵敏度达20拷贝的RPA扩增体系。为了快速获取DNA，种子样品利用核酸释放剂获得可用于RPA扩增的模板，为了消除叶片中叶绿素并快速获取DNA，叶片样品利用本实验室研发的核酸快速一体化提取装置快速获取DNA，以消除叶绿素干扰。结合便携式金属浴启动RPA扩增，蓝光切胶仪用于可视化检测，构建了转基因玉米和大豆的现场快速检测方法。该方法检测时间约为20 min，与常规PCR检测结果一致，适用于现场快速检测，无需大型设备，具备较强的实用性和适应性。该方法为转基因作物现场检测提供了技术支持，并为其他核酸快速检测技术的应用提供参考。

单细胞转录组测序(single-cell transcriptome sequencing, scRNA-seq)通过高通量获取单细胞转录丰度数据，能够深入揭示细胞类型、亚型组成、特异性基因标记及功能差异，广泛应用于动植物发育生物学和重要性状解析等领域。然而，scRNA-seq数据常伴随高噪声、高维度和批次效应等问题，导致大量低表达基因和变异的出现，严重影响数据分析的准确性和可靠性。这不仅增加了数据处理的复杂性，还制约了特征选择和下游分析的效果。尽管已有多种统计推断和机器学习方法用于应对这些挑战，但在细胞类型识别、特征选择以及批次效应校正等方面，现有方法仍存在着局限性，难以满足复杂生物学研究的需求。因此本研究提出了一种创新的单细胞分类方法scIC (single-cell image classification)，将scRNA-seq数据转换为图像形式，并结合深度学习技术进行细胞分类。通过这种图像转换的方式能够更有效地捕捉数据中的复杂模式，进而利用卷积神经网络(convolutional neural networks, CNN)和残差网络(residual network, ResNet)构建高效的分类模型。在测试4种细胞类型(小鼠皮肤基底细胞、小鼠淋巴细胞、人类神经元细胞和小鼠脊髓细胞)的scRNA-seq数据后，分类模型的准确率均超过94%，其中小鼠皮肤基底细胞数据集使用ResNet50模型时的分类准确率高达99.8%。这些结果表明，将scRNA-seq数据进行图像转换并与深度学习技术结合，能够显著提高分类准确性，为解决单细胞数据分析中的关键挑战提供了新思路和有效工具。本研究代码已公开于：https://github.com/Bingxi-Gao/ SCImageClassify。

近年来，统计学和机器学习方法被广泛用于分析人体肠道微生物宏基因组与代谢性疾病之间的关系，这对于微生物群落的功能注释和开发具有重要意义。本研究提出了一种新的可推广的肠道宏基因组图像增强和深度学习框架，用于人类代谢性疾病的分类预测。将3个代表性人类肠道宏基因组数据集中的每个数据样本分别转换为图像并进行数据增强，输入逻辑回归(logistic regression, LR)、支持向量机(support vector machine, SVM)、贝叶斯网络(Bayesian network, BN)和随机森林(random forest, RF)机器学习模型以及多层感知机(muti-layer perception, MLP)和卷积神经网络(convolutional neural network, CNN)深度学习模型。使用准确率(accuracy, A)、精确率(precession, P)、召回率(recall, R)、F1分数(F1-score)和ROC(receiver operating characteristic)曲线下面积(area under the curve, AUC)5个指标以及10折交叉验证整体评估模型疾病预测的精度性能。结果显示：MLP模型的整体表现优于CNN、LR、SVM、BN、RF以及PopPhy-CNN方法，且经过数据增强(随机旋转和添加椒盐噪声)后，MLP和CNN的模型性能均有进一步提升。MLP模型进行疾病预测的准确率进一步提高了4%~11%，F1提高了1%~6%，AUC提高了5%~10%。以上结果表明，人类肠道宏基因组图像增强和深度学习可以准确地提取微生物群特征，有效预测宿主疾病表型。本研究中使用的源代码和数据集均公开发表在Github中： https://github.com/HuaXWu/GM_ML_Classification.git。

酶功能的识别对理解生命活动的机制、推进生命科学的发展有重要作用。然而现有的酶EC编号预测方法，并未充分利用蛋白质序列信息，在识别精度上仍有所不足。针对上述问题，本研究提出一种基于层级特征和全局特征的EC编号预测网络(EC number prediction network using hierarchical features and global features, ECPN-HFGF)。该方法首先通过残差网络提取蛋白质序列通用特征，并通过层级特征提取模块和全局特征提取模块进一步提取蛋白质序列的层级特征和全局特征，之后结合两种特征信息的预测结果，采用多任务学习框架，实现酶EC编号的精确预测。计算实验结果表明，ECPN-HFGF方法在蛋白质序列EC编号预测任务上性能最佳，宏观F1值和微观F1值分别达到95.5%和99.0%。ECPN-HFGF方法能有效结合蛋白质序列的层级特征和全局特征，快速准确预测蛋白质序列EC编号，比当前常用方法预测精确度更高，能够为酶学研究和酶工程应用的发展提供一种高效的思路和方法。

基因组预测已成为畜禽、作物遗传评估和人类疾病风险预测的主要技术，但经典的基因组预测方法在性状遗传调控机制等生物学先验信息的整合方面有一定的不足。本研究提出一种将mRNA转录本信息整合应用于复杂性状表型预测的方法。基于国际上广泛应用于数量遗传学研究的果蝇群体，对本研究提出的新方法进行准确性评估。结果显示，整合mRNA转录本，可有效提高部分性状基因组预测准确性，但对部分性状的表型预测准确性没有改善。与GBLUP相比，雄性果蝇D-香芹酮嗅觉反应(dCarvone)准确性由0.256提高到0.274，提高幅度7%。雄性果蝇咖啡因耐受反应(cafe)准确性由0.355提高到0.401，提高幅度13%。雄性果蝇百草枯耐受反应(survival_paraquat)准确性由0.101提高到0.138，提高幅度36%。雌性果蝇1-已醇嗅觉反应(1hexanol)准确性由0.147提高到0.210，提高幅度43%。综上所述，对于部分性状，通过整合mRNA转录本可有效提高基因组预测准确性(提高幅度为7%~43%)。对于部分性状，整合mRNA转录本并考虑互作效应可进一步提高预测准确性。

在法医DNA分析领域，混合短串联重复序列(short tandem repeats，STR)图谱的分析一直是研究难点。当前，国内主要依靠法医进行人工分析，不仅效率低下，分析结果还存在着主观性偏好，难以满足日益增长的STR图谱分析的需求。本文提出一种新的混合STR图谱分析方法——全局最小残差法，不仅可以计算出分析结果，还可以预测出每个组分的混合比例。该方法首先给混合比例赋予了新的定义，然后对等位基因模型进行优化，进而综合考虑STR图谱中的所有基因座，将每个基因座的残差值进行累加求和，选择累加和最小的混合比例作为推断结果，并使用灰狼优化算法快速寻找混合比例的最优值。对于二组分STR图谱，全局最小残差法能够兼顾分析的准确性和分析速度，有利于实现大量的图谱分析。本文提出的算法在实际应用中取得了不错的效果，具有较高的应用价值，可为混合STR图谱分析领域的研究提供新的解决方案。

本研究拟建立检测CK19基因表达的数字PCR(digital PCR，dPCR)方法并测试其性能，以期利用该方法的超高敏感性和绝对定量优势进行循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)的定量分析。首先，根据CK19基因的mRNA序列进行引物探针设计，以看家基因ABL1作为内参，采用人乳腺癌MCF7细胞和健康人白细胞从13套引物探针之中筛选出了最佳的引物探针，测序结果证实扩增序列无误。其次，针对选定的引物探针进行反应条件的优化，以不同浓度的健康人白细胞cDNA为模板进行空白检测限(limit of blank，LOB)的分析，证实当ABL1基因拷贝数为20,000、15,000、10,000、5000、2500时，CK19的LOB分别为9.24、8.93、3.12、3.17和2.53拷贝。再次，采用MCF7细胞和健康人白细胞的cDNA模板进行不同浓度预混的检测限(limit of detection，LOD)分析，证实50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%的浓度配比下均可以有效检出CK19基因，线性R²值为0.9998。最终，临床样本的数字PCR检测结果发现晚期乳腺癌患者的CK19拷贝数高于健康人对照。上述结果说明本研究所建立的检测CK19基因的数字PCR方法具有敏感、特异和定量准确等优势，未来经过进一步验证之后有望用于乳腺癌的CTC定量分析，具有良好的应用前景。

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种常染色体隐性遗传、儿童致死性神经系统疾病。SMA致病基因为运动神经元存活基因(survival motor neuron1, SMN1)。虽然检测SMN1基因拷贝数的方法众多,但目前适于大规模人群筛查的技术较少。为寻求一种快速准确的实验技术可以用于人群中SMA携带者的大规模筛查,了解区域人群携带情况及常见变异的分布,本研究应用多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术检测12例SMA患者及其父母SMN1基因拷贝数,同时对江苏地区151例健康孕妇人群SMN1基因进行拷贝数检测,并通过多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)技术验证检测结果。多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术结果与MLPA结果一致,显示12例SMA患者均为SMN1基因零拷贝,其父母的SMN1基因拷贝数均为单拷贝,151例健康人群中检测出SMN1基因单拷贝3例(即SMA携带者),占2.0%;SMN1基因双拷贝134例,占88.7%;SMN1基因大于双拷贝14例,占9.3%。因此,多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术作为一种快速、简便和准确的检测技术具有着应用于人群中SMA携带者的大规模筛查的潜力。

肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是一种骨骼肌生长发育的负调控因子,可以抑制成肌细胞的增殖,是动物品种改良的重要候选基因,该基因突变能够引起骨骼肌的广泛性增生与肥大,产生“双肌”症状,导致动物脂肪分化减少、肌肉含量增加,从而满足市场动物肉品质消费的需求。为了获得“双肌”表型的MSTN基因突变克隆山羊,本研究在山羊MSTN基因第一外显子序列设计并构建TALENs表达载体,转染山羊胎儿成纤维细胞,经嘌呤霉素筛选获得抗性细胞株,通过PCR检测和基因测序筛选MSTN基因突变细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植,并鉴定MSTN基因突变类型;通过组织切片分析MSTN基因突变山羊肌肉组织形态结构,监测不同月龄克隆山羊体重并分析其不同生长发育阶段的体重增长趋势。结果表明,共获得109株MSTN基因突变细胞株,突变效率达到79.0% (109/138),其中46株为双等位基因突变,占细胞株总数的33.3% (46/138)。选取4株生长状态较好的MSTN基因突变细胞株(1株为双等位基因纯合突变,3株为非纯合突变)进行体细胞核移植至12只受体山羊,30 d时B超检查出受孕母羊4只,受孕率为33.3% (4/12),妊娠到期分娩2只克隆山羊,测序结果表明M-1克隆山羊MSTN双等位基因中的一个等位基因未产生突变,另一个等位基因缺失3 bp;M-2克隆山羊MSTN双等位基因中的一个等位基因产生1 bp碱基插入,另一个等位基因缺失13 bp,两种突变均造成MSTN在突变位点之后的蛋白序列丢失。此外,M-1克隆山羊肌纤维排列紧密且粗大,每月体重均高于普通野生型山羊,但与普通野生型山羊生长趋势一致,且能够健康发育至成年。本研究利用TALENs技术成功介导山羊MSTN基因定点修饰,并获得MSTN基因突变的山羊胎儿成纤维细胞,将其作为供核细胞成功生产MSTN基因突变克隆山羊,为培育“双肌”表型山羊新品系奠定了技术基础,也为将来其他转基因动物的制备提供了参考方法。

昼夜节律是指生命活动以24小时为周期的内在性节律。为了适应昼夜环境周期性的变化,地球上几乎所有生物体,包括藻类、细菌、植物、动物等,都演化出一个特殊的系统——生物钟,用以指挥不同组织与器官来适应环境的昼夜交替,维持机体的生理稳态和行为与环境昼夜变化同步。生物钟是指由内源性分子时钟控制的日周生理振荡过程,人类生命活动的各个层面,包括行为、生理、代谢等都受到生物钟的调控,并表现出明显的昼夜节律,如睡眠与苏醒、警觉程度与运动能力、体温波动、泌尿系统、激素分泌、免疫调节以及细胞因子释放等。昼夜节律紊乱可能影响各种疾病的发生、发展、治疗和预后。因此在机体的发育、衰老及疾病的发生、发展过程中评估昼夜节律是否异常具有重要的意义。结合本课题组相关研究,本文较为系统性地讨论了几种适用不同目的鉴别昼夜节律行为异常的方法,分享了具体的实验操作以及分析思路,包括利用代谢笼测量活动节律、自由跑轮活动监测、倒时差、长光照、骨骼光周期以及T7-cycle,并解释了不同行为学方法背后的生理意义。除此之外,本文还探究了不同遗传背景以及不同来源小鼠的昼夜节律在适应外界环境变化上的可能差异,为相关研究提供了可行的参考。根据这些原则及方法,以期帮助相关科研人员选择合适的实验来评估遗传因素、环境因素或疾病对昼夜节律行为的影响。

微卫星作为重要的分子标记之一,已被证明在大熊猫种群规模评估、亲子鉴定和遗传多样性分析方面是有效的。目前微卫星标记在大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)染色体上物理定位方面的报道较少,而且缺乏微卫星基因分型系统的效能评估以及PCR扩增条件的优化。本研究基于大熊猫基因组参考序列(ASM200744v2),分析了34个大熊猫微卫星位点的染色体定位特征并评价了位点的应用价值。通过优化34个STR-PCR反应体系和扩增程序,结合微卫星的染色体定位数据确定了Ame-μ10标记的较低应用价值以及gpz-6重新筛选引物的必要性。本研究有助于提高基因分型结果的重复性和可靠性,对促进《大熊猫种群遗传档案建立技术规程》规范化应用和制定大熊猫保护策略具有重要意义。

蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation, PTS)是一种重要的翻译后修饰,调控生命活动中多种生理和病理过程,但由于PTS状态不稳定且目前缺乏有效的富集方法,因此在生物样品中难以进行有效地检测。本研究以模式动物斑马鱼(Danio rerio)为研究材料,利用Orbitrap Exploris 480高分辨质谱仪检测了斑马鱼胚胎发育早期总蛋白的酪氨酸硫酸化修饰水平,通过该方法共计检测到26种蛋白(包括膜蛋白、分泌蛋白、胞质蛋白和核蛋白等)存在潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点。本研究建立了斑马鱼胚胎发育早期蛋白酪氨酸硫酸化修饰的检测方法,为探索生物体蛋白硫酸化修饰的作用机制奠定了技术基础。

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是近年来流行的一种主要致病病毒,对我国的国民经济生活造成了严重影响。本研究以非洲猪瘟病毒的编码保守蛋白p54基因序列片段为检测目标,结合点亮 Spinach RNA适配体的开关功能,设计了Spinach-p54的嵌合式RNA适配体。其特异地结合目标序列并产生荧光,实现了在RNA水平上对非洲猪瘟病毒的快速检测。研究结果表明,核酸适配体浓度200 nmol/L,反应温度为37 ℃,该方法检出限为200 nmol/L,线性范围为200~400 nmol/L。该方法特异性强,操作简单,灵敏度高等特点,可用于市场和养殖场的现场快速检测。

转基因玉米双抗12-5具有良好的抗虫性和除草剂耐受性,是我国第一批获得安全证书的转基因玉米之一,具有广阔的应用前景。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)建立转基因玉米双抗12-5的现场快速检测方法。针对转基因玉米双抗12-5的转化体特异性序列片段,设计引物和探针,通过引物筛选实验得到最佳引物与探针组合。荧光RPA扩增结果可以在蓝光下直接进行可视化分析。结果表明,建立的转基因玉米双抗12-5可视化检测体系特异性强,检测灵敏度达到10拷贝。进一步研究发现RPA的扩增体系对温度有很强的适应性,样品在34℃~46℃之间都能得到扩增,据此,本研究利用市面上常见的自发热暖贴代替常规的加热仪器来激发RPA。结果表明,自发热暖贴满足RPA扩增体系对温度的需要。最终,本研究将自发热暖贴加热法与RPA可视化检测体系结合,对转基因玉米双抗12-5进行现场检测,并与qPCR方法检测结果作比较,检测结果表明,本研究建立的现场可视化检测方法与qPCR方法检测结果一致,并且可视化检测方法时间短,检测结果清晰易分辨。本研究建立的转基因玉米双抗12-5现场快速可视化检测方法,其特异性强、灵敏度高、方便、快捷,不仅满足了转基因玉米双抗12-5的现场快速检测的需要,也为其他现场快速检测方法的开发提供了新思路。

胰高血糖素样肽1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1)作为一种肠促胰岛素,主要由肠道L细胞分泌,由于其能够有效促进胰岛素的释放从而降低血糖,因此GLP-1及其类似物在2型糖尿病的治疗上具有良好的应用前景。本研究优化了慢病毒感染类器官的方法,利用该方法成功构建了GLP-1过表达的小鼠小肠类器官(organoids)。结果显示该类器官分泌的GLP-1能够有效地提高野生型及糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力。因此,本研究构建的GLP-1过表达类器官可以为2型糖尿病的治疗提供一种新的策略。

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)是一种遗传相关的神经系统发育性疾病,患者主要呈现社交缺陷、沟通障碍、重复刻板行为和学习记忆障碍等核心症状。小鼠模型是探究孤独症谱系障碍的致病机理和寻找潜在治疗方法的重要工具,而小鼠行为学的观测和分析可以帮助人们更好地了解不同遗传操作对相应孤独症表型的影响,从而阐释疾病机理。本文列举了针对孤独症患者核心缺陷的相关小鼠行为学分析方法,包括检测社交缺陷的三厢社交实验、居住者-入侵者实验、筑巢实验和超声波检测;检测重复刻板行为的Y迷宫自主选择实验、捋毛实验、刻板行为分析实验和弹珠埋藏实验;检测焦虑行为的旷场实验、高架十字迷宫实验和明暗穿梭实验;检测学习和记忆障碍的新事物选择实验和水迷宫实验。本文详细描述了这些行为学实验的标准操作流程、注意事项以及规范的数据分析方法,可以帮助研究人员进行相关实验设计。同时本文对已知孤独症小鼠遗传模型中的各项行为学表型进行了汇总和比较,为相关研究人员提供系统参照。

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment, CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质- DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)的实验过程。CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响。通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag, srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收。本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶II (RNA polymerase II, RNAPII)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization, SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收。结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下。在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段。在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别。因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息。综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择。

为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)的最佳转染效率,本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX & Plus Reagent)中PGCs的转染效率,利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology, FACS)辅助优化Lipofectamine 3000转染试剂,经FACS进一步分选获得带绿色荧光蛋白(GFP)的PGCs,继续培养3周后,移植回注到受体鸡胚中,移植3.5 d后分离性腺拍照观察。结果显示,转染试剂Lipofectamine 3000的转染效率最高,质粒、Lipofectamine 3000转染试剂和PGCs细胞数的配比为3 μg: 4 μL: 0.5×10 ⁴个,转染5 h转染效率最高,达到23.4%,与现有的研究结果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受体鸡胚中,荧光显微镜观察到鸡胚性腺中有GFP阳性细胞。本研究综合考虑转染试剂、质粒用量和细胞数量的影响因素以优化PGCs的转染条件,为高效制备转基因鸡及基因编辑鸡的研究奠定基础。

阿胶(Asini Colla Corii)及其原料皮张源性成分的鉴定是对阿胶真实性的一种保障,阿胶生产企业和市场监管部门急需马、驴、骡皮张以及阿胶中源性成分鉴别的有效检测方法。本研究基于马、驴核基因组和线粒体基因组筛选物种特异性DNA序列作为检测靶标,设计马、驴特异性引物,建立了鉴别马、驴、骡皮张以及鉴定阿胶中马和驴源性成分的多重PCR方法。结果显示,本文所建立的方法可用于阿胶源性成分及皮张种源的鉴别,其特异性强,只在目标物种中扩增出目的条带,而非目标物种中没有任何扩增产物,而且灵敏度能达到0.2 ng,可为阿胶生产企业和市场监管部门提供技术支撑。

分析基因碱基突变是探究肿瘤细胞克隆演化的研究方法之一。目前,常取组织不同区域的群体细胞测序,基于群体水平的基因碱基突变频率等信息绘制出肿瘤的克隆演化过程。但是,该方法易遗失低频突变,并且组织群体细胞类型不单一,不能代表特定细胞群体的克隆演化过程。本研究以前列腺基底细胞癌(prostate basal cell carcinoma, BCC)为例,建立了一种探究肿瘤单细胞的基因碱基突变方法,实现了基于单细胞基因碱基突变分析肿瘤细胞的克隆演化过程。首先通过HepG2细胞优化了单细胞全基因组扩增方法,其次用Fluidigm公司的微流控芯片捕获BCC单细胞进行全基因组扩增,然后通过外显子组测序获得SCUBE3和MST1L基因碱基突变信息。通过单细胞靶向扩增和Sanger测序,成功在BCC单细胞中检测到SCUBE3和MST1L基因碱基突变信息。本研究建立的方法为肿瘤细胞的克隆演化研究提供了一种可靠的技术方案。

结直肠癌是世界高发和高致死率的恶性肿瘤。靶向新抗原的免疫治疗已被证实可以诱导癌症患者肿瘤持续消退,但这些特异性新抗原,仅适用于个体精准治疗。随着大量的高频肿瘤基因突变被发现,这些与突变相关的高频新抗原可覆盖更多人群,具有较强的临床意义。然而目前结直肠癌中是否也存在高频新抗原仍不清楚。本研究利用来源于321个结直肠癌患者的体细胞突变数据库,联合1种标准过滤和7种预测算法,筛选并获得了25个基于中国人高频分型HLA-A*1101限制性的高频新抗原,它们均具有高亲和力(IC₅₀<50 nmol/L)和高呈递分值(>0.90);其中,除了阳性对照多肽KRAS_G12V_8-16外,11个高频新抗原能够在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)分泌γ干扰素(interferon gamma, IFN-γ),证实具有免疫原性。选取免疫原性最强的新抗原C1orf170_S418G_413-421及阳性对照多肽KRAS_G12V_8-16体外刺激T细胞,利用流式细胞分选及单细胞转录组测序技术,获得其特异性CTL的免疫组库信息,所构建的TCR-T（T-cell receptor engineered T cell）能够识别新抗原并分泌细胞因子。以上结果表明,本研究开发了一种利用体细胞数据库预测并体外筛选验证具有免疫原性高频新抗原的方法,为结直肠癌及其他癌种的多肽、DC（dendritic cells）疫苗、TCR-like抗体、TCR-T等免疫治疗提供了重要的多肽靶点和TCR信息,具有实际的临床应用价值。

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)的高分辨率、精准分型对于组织配型以及HLA相关疾病研究具有重要意义。本研究以12位原发性肝细胞癌病人的外周血为供试样本,分析二、三代测序数据用于高分辨率HLA分型的优劣势,同时结合探针捕获与三代测序技术对YH、HeLa标准细胞系以及一个原发性肝细胞癌病人的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)区域进行靶向分析,探究长读长测序技术对于整个MHC区域精细分析的潜力。研究表明：(1)二、三代测序技术均能实现6~8位高分辨HLA分型,且两者分型结果一致。但是三代数据的覆盖均一度显著优于二代,不会出现明显的“断层”现象;(2)超长的三代数据可直接跨越整个扩增子,对于基因单倍体型的判定(phasing)具有明显优势。样本中92.79%的HLA基因能够得到准确的单倍体分型结果,远高于二代的75.65%;(3)长读长的三代测序数据不但能实现对MHC区域的更好组装,还具有对整个MHC共计3.6 Mb区域进行phasing的能力,而这将有助于明确各个突变位点、等位基因、非编码区等基因原件在每个MHC单倍体型上的定位与相互连锁信息,为免疫等相关疾病的研究提供理论依据。

肿瘤细胞的异质性是指肿瘤细胞在基因组或表型水平上具有不同特征。在外界环境压力或人为杀伤因素刺激下,肿瘤细胞具有不同的响应方式,从而导致它们在细胞增殖、侵袭转移及耐药能力等方面产生差别,尤其是一部分具有转移能力的肿瘤细胞能脱离原位组织并在远处器官形成转移灶。因此,肿瘤细胞的异质性为其发生转移和耐药提供了可能。传统的肿瘤异质性研究主要基于不同位置原位组织样本中的群体细胞,缺乏单细胞层面的解析,尤其是对具有转移能力的肿瘤细胞的异质性研究。本研究建立了基于肺癌恶性胸腔积液中转移性肿瘤细胞的单细胞研究路线,首先利用代谢标志物鉴定恶性胸腔积液中高代谢活性的肿瘤细胞,其次通过单细胞Sanger测序揭示这些肿瘤细胞具有一致的驱动基因突变特征,然后利用高通量测序技术对肿瘤细胞染色体拷贝数变异进行分析,从而揭示同一患者具有转移能力的肿瘤细胞即使具有相同的驱动基因突变特征,但在基因组层面上仍具有异质性,可进一步细分为若干子群。本研究结果对于更深入地理解肿瘤转移机制具有重要意义。

随着干细胞研究的不断深入,干细胞功能分化研究和临床应用转化的需求日益提升。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)来源广泛,不仅自我更新能力强、能够分化成多种类型的成体细胞,而且其自身具有免疫调节能力,不易引发免疫排斥反应,在干细胞功能分化研究和临床应用中具有巨大应用前景和应用潜力。目前,传统的细胞培养方式培养效率低、细胞活性较差,不能满足日益增长的研究和应用需求。本研究利用微载体结合旋转瓶的悬浮培养方法,通过优化细胞接种量及转速等影响因素,快速获得大量高质量的人脐带间充质干细胞。经悬浮培养总细胞量可高达到7×10 ⁸个细胞/L,而且细胞活性较高,MSC 特异性标记物表达良好,在恢复平面培养后仍能维持MSC的正常细胞形态和增殖能力。高效脐带间充质干细胞悬浮培养体系的初步建立,为未来的干细胞功能分化研究和临床应用奠定了基础。

染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)是一种通过对染色体进行全基因组扫描来筛查染色体数目和结构异常的检测技术,是儿科和产前遗传诊断的常规工具,已被应用于流产病因分析。本研究应用CMA技术在全基因组水平分析引起流产的染色体异常情况,并评估该技术在临床流产中的应用价值。对收集的2600例流产样本进行CMA技术检测,成功检测了2505例,成功率高达96.3%,其中1021例用CytoScan Optima芯片进行检测,1211例用CytoScan 750K芯片进行检测,273例用CytoScan HD芯片进行检测。利用这3种芯片共检出967例(38.60%)样本发生染色体异常,其中通过CytoScan Optima芯片检出506例(50.00%),CytoScan 750K芯片检出388例(32.00%),CytoScan HD芯片检出73例(26.74%)。在967例染色体异常中,有801例(82.83%)发生染色体数目异常,94例(9.72%)发生染色体结构异常,56例(5.79%)发生嵌合体,16例(1.65%)检出纯合区域。本研究结果表明,CMA可应用于临床流产物的遗传学诊断,是一种可靠、稳定、高分辨的技术,其检测结果能够对再生育风险评估提供指导。

伊立替康(irinotecan)不良反应与UGT1A1*6单核苷酸多态性相关,目前应用的单核苷酸多态性检测方法具有耗时长、开盖易污染、操作繁琐等缺点,因此需建立一种操作简便且不易污染的适合临床应用的新方法。本研究利用3种已知基因型的DNA样本建立基于级联核酸侵入反应的real-time PCR法检测UGT1A1*6多态性的最佳反应体系,并对其检测口腔咽拭子样本的灵敏度和准确性进行了考察。结果显示,本文成功建立了基于级联核酸侵入反应的UGT1A1*6基因多态性检测方法,可用于咽拭子样本的分型检测,其灵敏度达到6 ng DNA,分型准确性达到100%。因其取样方便对人体无创,单管闭管检测不易产生交叉污染,具有用于临床检测伊立替康的个体化用药相关UGT1A1*6基因多态性的潜力。

T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定非常重要,但是目前常用的方法如反向PCR、半随机引物PCR等,除了操作复杂、消耗时间长外,特异性较差,效率也很低。本研究利用全基因组重测序技术,将3份转基因材料基因组DNA打包后进行重测序,利用转基因载体序列作为参考序列进行比对分析,得到4个T-DNA插入位点。对3份转基因材料进行PCR和Southern blot验证分析,成功获得了3份转基因材料全部T-DNA插入位点,其中1份材料为2拷贝插入。本文利用重测序技术建立了一种简单、可靠、高效的获取转基因植物T-DNA插入位点的方法,以期为植物功能基因组学及转基因研究奠定基础。

为比较稀有变异遗传关联研究中常用负担检验方法(CMC、WST、SUM及其扩展)在不同遗传情境下的统计性能,本文通过计算机模拟产生不同样本量、连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)参数、混杂非关联变异的个数和不同效应的关联变异等条件的稀有变异病例对照数据集,运用各种负担检验方法进行分析,分别计算各方法的一类错误和效能。结果表明,各方法一类错误均在0.05附近;当稀有变异效应方向一致时,除aSUM法外,LD参数越大、混杂非关联变异越少、各法效能越高;当效应方向不一致时,各法效能则显著降低。除强LD外,有方向考虑的方法效能均比无方向考虑的方法高,且样本量越大效能越高。负担检验的统计性能受效应大小和方向、噪音变异和连锁不平衡等多种因素影响。在实际应用中,在各类方法选择、确定集合单位,权重等时最好结合遗传变异的生物信息先验以提高研究效能。

为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector? 2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM^? 830、NEPA 21和Nucleofector? 2b中的转染效率。结果显示：NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10%;Nucleofector? 2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率。ECM^? 830和Nucleofector? 2b的最适质粒用量都为10 μg,而NEPA 21为8 μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中Nucleofector? 2b转染效果最佳。本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础。

Hi-C(highest-throughput chromosome conformation capture)技术是近年出现的一种研究染色质相互作用的关键技术。该技术步骤多、耗时长,涉及的试剂耗材繁杂,目前常规流程还有较多可以改进优化的步骤。本研究以GM12878细胞为材料,通过优化常规Hi-C实验中的交联、酶切、限制性内切酶的失活、末端生物素标记、原位连接等关键步骤,建立了稳健的Hi-C流程,制备了相应的Hi-C文库。文库经初步的Sanger测序等质量控制以后,两个生物学重复文库进行了高通量测序。测序结果利用生物信息学处理发现：原始测序数据中可比对率和配对率分别达到90%和72%左右。此外,去除自连片段(self-circular ligation)和dangling-ends片段以后,可获得超过96%的有效相互作用对,其中染色体内相互作用数据达到60%。进一步的染色体相互作用热图分析可见清晰拓扑学相关结构域TADs(topologically associated domains),与已发表的文献报道一致。而两次生物学重复之间的相关性分析则表明bin coverage和all bin pairs的相关性都极强。上述结果表明通过对常规Hi-C流程关键步骤的优化,本研究建立了高效、稳健、可靠的Hi-C流程,对Hi-C技术的进一步使用与推广具有重要的参考价值。

从单细胞尺度进行细胞异质性的分析是深度理解细胞群体关系的关键。组织中的单细胞由于细胞类型不同,尺寸往往相差很大,但是目前常用的基于微孔板和Fluidigm公司的微流控的单细胞组学研究方法,需要入口的单细胞大小相近。本研究以胃组织为例,建立了一种组织单细胞的基因变异分析方法,实现了尺寸差异较大的单细胞的基因变异分析。在该方法中,先将胃组织裂解获得单个腺体,再将单个腺体酶解得到不同大小的腺体内单细胞,然后把这些单细胞铺在聚乙烯萘膜载玻片上,进行激光显微切割分选、全基因组放大,最后测其微卫星的长度。利用该方法,成功在肠上皮化生腺体内部检测到微卫星长度的变化,并灵活地对尺寸差异大的组织细胞以及肠化生腺体细胞进行了精细分析。此外,这种单细胞分析方法还可以对带有不同标记的细胞进行低通量和高通量的基因组分析,为单细胞尺度上的组织异质性研究提供了一种高度灵活的分析方法。

在核酸检测领域急需一种能够经济、快速、操作简便且同时检测多个靶标的新技术。常规多重PCR能够同时扩增多个靶标,但由于在一个试管中引物间的相互作用和竞争,重数往往受到限制。本研究设计了一种操作简单的多重PCR芯片,可以同时进行54个靶标的扩增。芯片结构简单,一条微通道将正下方平行排列的多个微孔连接在一起,微通道只留加样口和出样口。同时整个微通道呈疏水状态,微孔呈亲水状态。将不同的引物对和低溶点琼脂糖提前固定于不同的微孔中,通过一次加入PCR mix,并加入矿物油推动PCR mix进入到每个微腔室中,同时微孔也被矿物油相互隔离避免交叉反应。加样后将芯片放置于平板PCR仪上进行扩增,在整个反应过程中低溶点琼脂糖呈液态,反应结束后凝固成固体,便可引入核酸染料进行染色,最后利用自制小型的紫外照射仪上进行可视化检测和拍照记录。利用此平台成功实现了对7种非常重要和常用的转基因作物靶标的并行检测,结果显示此平台具有较高的灵活性和特异性。此技术经过进一步优化可应用于包括转基因检测在内的多重核酸检测领域。