遗传 ›› 2004, Vol. 26 ›› Issue (6): 836-840.
柳淑芳1;2;杜立新3;①;朱靖1;王爱华3
LIU Shu-Fang1,2;DU Li-Xin3,①;ZHU Jing1;WANG Ai-Hua3
摘要: mRNA 差异显示PCR( mRNA differential display PCR,DDRT-PCR)是分离差异表达基因的有效方法,但该方法的准确性极易受到外部因素和内部因素的影响。本研究采用正交法优化DDRT-PCR反应条件,充分考虑到模板浓度、锚定引物浓度、随机引物浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度以及Taq酶用量等因素在差异显示反应过程中的交互作用,一次PCR反应即可确定最佳反应组合。将筛选出的条件用于DDRT-PCR,得到差显结果假阳性率低,重复性和稳定性好,而且简化了反应条件的优选程序,这表明正交法是优化差异显示反应条件的理想方法。为了进一步简化整个差异显示反应系统的操作程序,降低假阳性率,研究采用了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和银染显示差异带的方法,并用反向Northern法来验证回收条带,从而更加优化了差异显示反应体系。