正交法整体优化差异显示反应体系

遗传 ›› 2004, Vol. 26 ›› Issue (6): 836-840.

正交法整体优化差异显示反应体系

柳淑芳^1;2;杜立新^3;①;朱靖¹;王爱华³

1.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018;2.国家水产品质量监督检验中心，青岛 266071;3.中国农业科学院畜牧研究所，北京 100094

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2004-12-10 发布日期:2004-12-10

Optimizing the Reaction System of DDRT-PCR by Positive-cross Test

LIU Shu-Fang^1，2;DU Li-Xin^3,①;ZHU Jing¹;WANG Ai-Hua³

1.College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018,China;2.The national center for quality supervision and test of aquatic product, Qingdao 266071, China;3.Institute of Animal Husbandry, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100094 ,China

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2004-12-10 Published:2004-12-10

摘要/Abstract

摘要： mRNA 差异显示PCR( mRNA differential display PCR，DDRT-PCR)是分离差异表达基因的有效方法，但该方法的准确性极易受到外部因素和内部因素的影响。本研究采用正交法优化DDRT-PCR反应条件，充分考虑到模板浓度、锚定引物浓度、随机引物浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度以及Taq酶用量等因素在差异显示反应过程中的交互作用，一次PCR反应即可确定最佳反应组合。将筛选出的条件用于DDRT-PCR，得到差显结果假阳性率低，重复性和稳定性好，而且简化了反应条件的优选程序，这表明正交法是优化差异显示反应条件的理想方法。为了进一步简化整个差异显示反应系统的操作程序，降低假阳性率，研究采用了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和银染显示差异带的方法，并用反向Northern法来验证回收条带，从而更加优化了差异显示反应体系。

关键词: 银染, 反向Northern, 非变性PAGE, DDRT-PCR, 正交优化

Abstract: The method of mRNA Differential display PCR (DDRT-PCR) is used to identify differentially expressed genes widely. To improve further the efficiency and reproducibility of the method, the positive-cross test were performed to find the optional conditions of DDRT-PCR by analyzing the six critical parameters of dNTPs, MgCl2, arbitrary primer, anchor primer, Taq enzyme, and template systematically. The experimental findings delineated the best possible DDRT-PCR conditions for a more reliable assessment of differential gene expression. Additionally, in this study, nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and silver straining were adopted to reduce the false-positive ratio, and the reclaimed fragments were detected by reverse Northern analysis. Finally, we obtained the optimal condition for DDRT-PCR.

柳淑芳，杜立新，朱靖，王爱华. 正交法整体优化差异显示反应体系[J]. 遗传, 2004, 26(6): 836-840.

LIU Shu-Fang, DU Li-Xin, ZHU Jing, WANG Ai-Hua. Optimizing the Reaction System of DDRT-PCR by Positive-cross Test[J]. HEREDITAS, 2004, 26(6): 836-840.

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