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1. CRISPR-Cas9基因编辑技术对细胞内源蛋白进行荧光标记的实验操作
吴仲胜, 高誉, 杜勇涛, 党颂, 何康敏
遗传    2023, 45 (2): 165-175.   DOI: 10.16288/j.yczz.22-395
摘要1007)   HTML56)    PDF(pc) (936KB)(875)    收藏

CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式引入外源序列,实现荧光蛋白或其他标签在基因组上的精准敲入,进而实现对内源蛋白进行荧光标签的融合标记。通过基因编辑技术对内源目的蛋白进行标记,可避免由于过表达造成蛋白质定位、动力学或功能等的潜在影响,可显著提升细胞成像实验的稳定性和可重复性。本文重点介绍了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对目的蛋白进行荧光蛋白或自标记蛋白标签标记的方法与操作流程,为构建内源蛋白荧光标记的哺乳动物细胞系提供参考。

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2. 利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑大鼠模型
刘梅珍, 王立人, 李咏梅, 马雪云, 韩红辉, 李大力
遗传    2023, 45 (1): 78-87.   DOI: 10.16288/j.yczz.22-354
摘要526)   HTML13)    PDF(pc) (1091KB)(362)    收藏

RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。

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3. CUT&Tag技术在代谢组织细胞的实验操作
张子寅, 周燕萍, 孟卓贤
遗传    2022, 44 (10): 958-966.   DOI: 10.16288/j.yczz.22-253
摘要490)   HTML13)    PDF(pc) (795KB)(397)    收藏

染色体靶向切割和标签化(clevage under target and tagment, CUT&Tag)技术利用Tn5转座酶与Protein A/G的融合蛋白,引导Tn5酶至与靶蛋白结合的抗体附近,对靶蛋白结合的附近染色质区域进行切割,随后通过标签化处理对片段化染色质进行文库制备,并利用高通量测序技术获取特定位点或蛋白质结合位置的染色质信息。CUT&Tag技术在蛋白质和DNA相互作用的研究领域起到了重大作用,不仅可以了解组蛋白修饰发生的位置,而且可以明确转录因子结合的区域。相较于传统的染色质免疫沉淀高通量测序(chromatin immunoprecipitation- sequencing, ChIP-seq)技术,CUT&Tag技术具有信噪比高、可重复性好、实验周期短、细胞投入量低等优点,在早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域体现出巨大优势。本文将针对CUT&Tag在代谢组织细胞(以小鼠原代胰岛细胞为例)的具体操作步骤进行描述,以提供一种研究代谢细胞的表观遗传学方法。

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4. 小鼠葡萄糖钳夹技术方法的建立与操作
龚颖芸, 付真真, 周红文
遗传    2022, 44 (10): 967-974.   DOI: 10.16288/j.yczz.22-252
摘要808)   HTML28)    PDF(pc) (724KB)(639)    收藏

葡萄糖代谢是机体能量代谢的核心,在各个组织器官发挥能量供应及代谢调控作用,胰岛素是机体内唯一的降糖激素。胰岛功能及胰岛素敏感性是影响葡萄糖代谢的关键环节。葡萄糖钳夹技术是评估胰岛素敏感性及胰岛功能的金标准,主要类别包括高胰岛素正糖钳夹、高糖钳夹、高胰岛素低糖钳夹等类型。在小鼠葡萄糖钳夹实验中根据是否麻醉分为麻醉和清醒状态钳夹。本文重点阐述了小鼠葡萄糖钳夹技术方法的建立及操作的具体流程,包括器械耗材的准备、手术操作、钳夹过程及注意事项,旨在为实验室搭建各类小鼠葡萄糖钳夹技术平台提供参考。

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