在法医DNA分析领域，混合短串联重复序列(short tandem repeats，STR)图谱的分析一直是研究难点。当前，国内主要依靠法医进行人工分析，不仅效率低下，分析结果还存在着主观性偏好，难以满足日益增长的STR图谱分析的需求。本文提出一种新的混合STR图谱分析方法——全局最小残差法，不仅可以计算出分析结果，还可以预测出每个组分的混合比例。该方法首先给混合比例赋予了新的定义，然后对等位基因模型进行优化，进而综合考虑STR图谱中的所有基因座，将每个基因座的残差值进行累加求和，选择累加和最小的混合比例作为推断结果，并使用灰狼优化算法快速寻找混合比例的最优值。对于二组分STR图谱，全局最小残差法能够兼顾分析的准确性和分析速度，有利于实现大量的图谱分析。本文提出的算法在实际应用中取得了不错的效果，具有较高的应用价值，可为混合STR图谱分析领域的研究提供新的解决方案。

本研究拟建立检测CK19基因表达的数字PCR(digital PCR，dPCR)方法并测试其性能，以期利用该方法的超高敏感性和绝对定量优势进行循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)的定量分析。首先，根据CK19基因的mRNA序列进行引物探针设计，以看家基因ABL1作为内参，采用人乳腺癌MCF7细胞和健康人白细胞从13套引物探针之中筛选出了最佳的引物探针，测序结果证实扩增序列无误。其次，针对选定的引物探针进行反应条件的优化，以不同浓度的健康人白细胞cDNA为模板进行空白检测限(limit of blank，LOB)的分析，证实当ABL1基因拷贝数为20,000、15,000、10,000、5000、2500时，CK19的LOB分别为9.24、8.93、3.12、3.17和2.53拷贝。再次，采用MCF7细胞和健康人白细胞的cDNA模板进行不同浓度预混的检测限(limit of detection，LOD)分析，证实50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%的浓度配比下均可以有效检出CK19基因，线性R²值为0.9998。最终，临床样本的数字PCR检测结果发现晚期乳腺癌患者的CK19拷贝数高于健康人对照。上述结果说明本研究所建立的检测CK19基因的数字PCR方法具有敏感、特异和定量准确等优势，未来经过进一步验证之后有望用于乳腺癌的CTC定量分析，具有良好的应用前景。

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种常染色体隐性遗传、儿童致死性神经系统疾病。SMA致病基因为运动神经元存活基因(survival motor neuron1, SMN1)。虽然检测SMN1基因拷贝数的方法众多,但目前适于大规模人群筛查的技术较少。为寻求一种快速准确的实验技术可以用于人群中SMA携带者的大规模筛查,了解区域人群携带情况及常见变异的分布,本研究应用多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术检测12例SMA患者及其父母SMN1基因拷贝数,同时对江苏地区151例健康孕妇人群SMN1基因进行拷贝数检测,并通过多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)技术验证检测结果。多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术结果与MLPA结果一致,显示12例SMA患者均为SMN1基因零拷贝,其父母的SMN1基因拷贝数均为单拷贝,151例健康人群中检测出SMN1基因单拷贝3例(即SMA携带者),占2.0%;SMN1基因双拷贝134例,占88.7%;SMN1基因大于双拷贝14例,占9.3%。因此,多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术作为一种快速、简便和准确的检测技术具有着应用于人群中SMA携带者的大规模筛查的潜力。

肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是一种骨骼肌生长发育的负调控因子,可以抑制成肌细胞的增殖,是动物品种改良的重要候选基因,该基因突变能够引起骨骼肌的广泛性增生与肥大,产生“双肌”症状,导致动物脂肪分化减少、肌肉含量增加,从而满足市场动物肉品质消费的需求。为了获得“双肌”表型的MSTN基因突变克隆山羊,本研究在山羊MSTN基因第一外显子序列设计并构建TALENs表达载体,转染山羊胎儿成纤维细胞,经嘌呤霉素筛选获得抗性细胞株,通过PCR检测和基因测序筛选MSTN基因突变细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植,并鉴定MSTN基因突变类型;通过组织切片分析MSTN基因突变山羊肌肉组织形态结构,监测不同月龄克隆山羊体重并分析其不同生长发育阶段的体重增长趋势。结果表明,共获得109株MSTN基因突变细胞株,突变效率达到79.0% (109/138),其中46株为双等位基因突变,占细胞株总数的33.3% (46/138)。选取4株生长状态较好的MSTN基因突变细胞株(1株为双等位基因纯合突变,3株为非纯合突变)进行体细胞核移植至12只受体山羊,30 d时B超检查出受孕母羊4只,受孕率为33.3% (4/12),妊娠到期分娩2只克隆山羊,测序结果表明M-1克隆山羊MSTN双等位基因中的一个等位基因未产生突变,另一个等位基因缺失3 bp;M-2克隆山羊MSTN双等位基因中的一个等位基因产生1 bp碱基插入,另一个等位基因缺失13 bp,两种突变均造成MSTN在突变位点之后的蛋白序列丢失。此外,M-1克隆山羊肌纤维排列紧密且粗大,每月体重均高于普通野生型山羊,但与普通野生型山羊生长趋势一致,且能够健康发育至成年。本研究利用TALENs技术成功介导山羊MSTN基因定点修饰,并获得MSTN基因突变的山羊胎儿成纤维细胞,将其作为供核细胞成功生产MSTN基因突变克隆山羊,为培育“双肌”表型山羊新品系奠定了技术基础,也为将来其他转基因动物的制备提供了参考方法。

昼夜节律是指生命活动以24小时为周期的内在性节律。为了适应昼夜环境周期性的变化,地球上几乎所有生物体,包括藻类、细菌、植物、动物等,都演化出一个特殊的系统——生物钟,用以指挥不同组织与器官来适应环境的昼夜交替,维持机体的生理稳态和行为与环境昼夜变化同步。生物钟是指由内源性分子时钟控制的日周生理振荡过程,人类生命活动的各个层面,包括行为、生理、代谢等都受到生物钟的调控,并表现出明显的昼夜节律,如睡眠与苏醒、警觉程度与运动能力、体温波动、泌尿系统、激素分泌、免疫调节以及细胞因子释放等。昼夜节律紊乱可能影响各种疾病的发生、发展、治疗和预后。因此在机体的发育、衰老及疾病的发生、发展过程中评估昼夜节律是否异常具有重要的意义。结合本课题组相关研究,本文较为系统性地讨论了几种适用不同目的鉴别昼夜节律行为异常的方法,分享了具体的实验操作以及分析思路,包括利用代谢笼测量活动节律、自由跑轮活动监测、倒时差、长光照、骨骼光周期以及T7-cycle,并解释了不同行为学方法背后的生理意义。除此之外,本文还探究了不同遗传背景以及不同来源小鼠的昼夜节律在适应外界环境变化上的可能差异,为相关研究提供了可行的参考。根据这些原则及方法,以期帮助相关科研人员选择合适的实验来评估遗传因素、环境因素或疾病对昼夜节律行为的影响。

微卫星作为重要的分子标记之一,已被证明在大熊猫种群规模评估、亲子鉴定和遗传多样性分析方面是有效的。目前微卫星标记在大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)染色体上物理定位方面的报道较少,而且缺乏微卫星基因分型系统的效能评估以及PCR扩增条件的优化。本研究基于大熊猫基因组参考序列(ASM200744v2),分析了34个大熊猫微卫星位点的染色体定位特征并评价了位点的应用价值。通过优化34个STR-PCR反应体系和扩增程序,结合微卫星的染色体定位数据确定了Ame-μ10标记的较低应用价值以及gpz-6重新筛选引物的必要性。本研究有助于提高基因分型结果的重复性和可靠性,对促进《大熊猫种群遗传档案建立技术规程》规范化应用和制定大熊猫保护策略具有重要意义。

蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation, PTS)是一种重要的翻译后修饰,调控生命活动中多种生理和病理过程,但由于PTS状态不稳定且目前缺乏有效的富集方法,因此在生物样品中难以进行有效地检测。本研究以模式动物斑马鱼(Danio rerio)为研究材料,利用Orbitrap Exploris 480高分辨质谱仪检测了斑马鱼胚胎发育早期总蛋白的酪氨酸硫酸化修饰水平,通过该方法共计检测到26种蛋白(包括膜蛋白、分泌蛋白、胞质蛋白和核蛋白等)存在潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点。本研究建立了斑马鱼胚胎发育早期蛋白酪氨酸硫酸化修饰的检测方法,为探索生物体蛋白硫酸化修饰的作用机制奠定了技术基础。

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是近年来流行的一种主要致病病毒,对我国的国民经济生活造成了严重影响。本研究以非洲猪瘟病毒的编码保守蛋白p54基因序列片段为检测目标,结合点亮 Spinach RNA适配体的开关功能,设计了Spinach-p54的嵌合式RNA适配体。其特异地结合目标序列并产生荧光,实现了在RNA水平上对非洲猪瘟病毒的快速检测。研究结果表明,核酸适配体浓度200 nmol/L,反应温度为37 ℃,该方法检出限为200 nmol/L,线性范围为200~400 nmol/L。该方法特异性强,操作简单,灵敏度高等特点,可用于市场和养殖场的现场快速检测。

转基因玉米双抗12-5具有良好的抗虫性和除草剂耐受性,是我国第一批获得安全证书的转基因玉米之一,具有广阔的应用前景。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)建立转基因玉米双抗12-5的现场快速检测方法。针对转基因玉米双抗12-5的转化体特异性序列片段,设计引物和探针,通过引物筛选实验得到最佳引物与探针组合。荧光RPA扩增结果可以在蓝光下直接进行可视化分析。结果表明,建立的转基因玉米双抗12-5可视化检测体系特异性强,检测灵敏度达到10拷贝。进一步研究发现RPA的扩增体系对温度有很强的适应性,样品在34℃~46℃之间都能得到扩增,据此,本研究利用市面上常见的自发热暖贴代替常规的加热仪器来激发RPA。结果表明,自发热暖贴满足RPA扩增体系对温度的需要。最终,本研究将自发热暖贴加热法与RPA可视化检测体系结合,对转基因玉米双抗12-5进行现场检测,并与qPCR方法检测结果作比较,检测结果表明,本研究建立的现场可视化检测方法与qPCR方法检测结果一致,并且可视化检测方法时间短,检测结果清晰易分辨。本研究建立的转基因玉米双抗12-5现场快速可视化检测方法,其特异性强、灵敏度高、方便、快捷,不仅满足了转基因玉米双抗12-5的现场快速检测的需要,也为其他现场快速检测方法的开发提供了新思路。

胰高血糖素样肽1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1)作为一种肠促胰岛素,主要由肠道L细胞分泌,由于其能够有效促进胰岛素的释放从而降低血糖,因此GLP-1及其类似物在2型糖尿病的治疗上具有良好的应用前景。本研究优化了慢病毒感染类器官的方法,利用该方法成功构建了GLP-1过表达的小鼠小肠类器官(organoids)。结果显示该类器官分泌的GLP-1能够有效地提高野生型及糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力。因此,本研究构建的GLP-1过表达类器官可以为2型糖尿病的治疗提供一种新的策略。

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)是一种遗传相关的神经系统发育性疾病,患者主要呈现社交缺陷、沟通障碍、重复刻板行为和学习记忆障碍等核心症状。小鼠模型是探究孤独症谱系障碍的致病机理和寻找潜在治疗方法的重要工具,而小鼠行为学的观测和分析可以帮助人们更好地了解不同遗传操作对相应孤独症表型的影响,从而阐释疾病机理。本文列举了针对孤独症患者核心缺陷的相关小鼠行为学分析方法,包括检测社交缺陷的三厢社交实验、居住者-入侵者实验、筑巢实验和超声波检测;检测重复刻板行为的Y迷宫自主选择实验、捋毛实验、刻板行为分析实验和弹珠埋藏实验;检测焦虑行为的旷场实验、高架十字迷宫实验和明暗穿梭实验;检测学习和记忆障碍的新事物选择实验和水迷宫实验。本文详细描述了这些行为学实验的标准操作流程、注意事项以及规范的数据分析方法,可以帮助研究人员进行相关实验设计。同时本文对已知孤独症小鼠遗传模型中的各项行为学表型进行了汇总和比较,为相关研究人员提供系统参照。

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment, CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质- DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)的实验过程。CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响。通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag, srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收。本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶II (RNA polymerase II, RNAPII)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization, SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收。结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下。在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段。在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别。因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息。综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择。

为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)的最佳转染效率,本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX & Plus Reagent)中PGCs的转染效率,利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology, FACS)辅助优化Lipofectamine 3000转染试剂,经FACS进一步分选获得带绿色荧光蛋白(GFP)的PGCs,继续培养3周后,移植回注到受体鸡胚中,移植3.5 d后分离性腺拍照观察。结果显示,转染试剂Lipofectamine 3000的转染效率最高,质粒、Lipofectamine 3000转染试剂和PGCs细胞数的配比为3 μg: 4 μL: 0.5×10 ⁴个,转染5 h转染效率最高,达到23.4%,与现有的研究结果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受体鸡胚中,荧光显微镜观察到鸡胚性腺中有GFP阳性细胞。本研究综合考虑转染试剂、质粒用量和细胞数量的影响因素以优化PGCs的转染条件,为高效制备转基因鸡及基因编辑鸡的研究奠定基础。

阿胶(Asini Colla Corii)及其原料皮张源性成分的鉴定是对阿胶真实性的一种保障,阿胶生产企业和市场监管部门急需马、驴、骡皮张以及阿胶中源性成分鉴别的有效检测方法。本研究基于马、驴核基因组和线粒体基因组筛选物种特异性DNA序列作为检测靶标,设计马、驴特异性引物,建立了鉴别马、驴、骡皮张以及鉴定阿胶中马和驴源性成分的多重PCR方法。结果显示,本文所建立的方法可用于阿胶源性成分及皮张种源的鉴别,其特异性强,只在目标物种中扩增出目的条带,而非目标物种中没有任何扩增产物,而且灵敏度能达到0.2 ng,可为阿胶生产企业和市场监管部门提供技术支撑。

分析基因碱基突变是探究肿瘤细胞克隆演化的研究方法之一。目前,常取组织不同区域的群体细胞测序,基于群体水平的基因碱基突变频率等信息绘制出肿瘤的克隆演化过程。但是,该方法易遗失低频突变,并且组织群体细胞类型不单一,不能代表特定细胞群体的克隆演化过程。本研究以前列腺基底细胞癌(prostate basal cell carcinoma, BCC)为例,建立了一种探究肿瘤单细胞的基因碱基突变方法,实现了基于单细胞基因碱基突变分析肿瘤细胞的克隆演化过程。首先通过HepG2细胞优化了单细胞全基因组扩增方法,其次用Fluidigm公司的微流控芯片捕获BCC单细胞进行全基因组扩增,然后通过外显子组测序获得SCUBE3和MST1L基因碱基突变信息。通过单细胞靶向扩增和Sanger测序,成功在BCC单细胞中检测到SCUBE3和MST1L基因碱基突变信息。本研究建立的方法为肿瘤细胞的克隆演化研究提供了一种可靠的技术方案。

结直肠癌是世界高发和高致死率的恶性肿瘤。靶向新抗原的免疫治疗已被证实可以诱导癌症患者肿瘤持续消退,但这些特异性新抗原,仅适用于个体精准治疗。随着大量的高频肿瘤基因突变被发现,这些与突变相关的高频新抗原可覆盖更多人群,具有较强的临床意义。然而目前结直肠癌中是否也存在高频新抗原仍不清楚。本研究利用来源于321个结直肠癌患者的体细胞突变数据库,联合1种标准过滤和7种预测算法,筛选并获得了25个基于中国人高频分型HLA-A*1101限制性的高频新抗原,它们均具有高亲和力(IC₅₀<50 nmol/L)和高呈递分值(>0.90);其中,除了阳性对照多肽KRAS_G12V_8-16外,11个高频新抗原能够在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)分泌γ干扰素(interferon gamma, IFN-γ),证实具有免疫原性。选取免疫原性最强的新抗原C1orf170_S418G_413-421及阳性对照多肽KRAS_G12V_8-16体外刺激T细胞,利用流式细胞分选及单细胞转录组测序技术,获得其特异性CTL的免疫组库信息,所构建的TCR-T（T-cell receptor engineered T cell）能够识别新抗原并分泌细胞因子。以上结果表明,本研究开发了一种利用体细胞数据库预测并体外筛选验证具有免疫原性高频新抗原的方法,为结直肠癌及其他癌种的多肽、DC（dendritic cells）疫苗、TCR-like抗体、TCR-T等免疫治疗提供了重要的多肽靶点和TCR信息,具有实际的临床应用价值。

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)的高分辨率、精准分型对于组织配型以及HLA相关疾病研究具有重要意义。本研究以12位原发性肝细胞癌病人的外周血为供试样本,分析二、三代测序数据用于高分辨率HLA分型的优劣势,同时结合探针捕获与三代测序技术对YH、HeLa标准细胞系以及一个原发性肝细胞癌病人的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)区域进行靶向分析,探究长读长测序技术对于整个MHC区域精细分析的潜力。研究表明：(1)二、三代测序技术均能实现6~8位高分辨HLA分型,且两者分型结果一致。但是三代数据的覆盖均一度显著优于二代,不会出现明显的“断层”现象;(2)超长的三代数据可直接跨越整个扩增子,对于基因单倍体型的判定(phasing)具有明显优势。样本中92.79%的HLA基因能够得到准确的单倍体分型结果,远高于二代的75.65%;(3)长读长的三代测序数据不但能实现对MHC区域的更好组装,还具有对整个MHC共计3.6 Mb区域进行phasing的能力,而这将有助于明确各个突变位点、等位基因、非编码区等基因原件在每个MHC单倍体型上的定位与相互连锁信息,为免疫等相关疾病的研究提供理论依据。

肿瘤细胞的异质性是指肿瘤细胞在基因组或表型水平上具有不同特征。在外界环境压力或人为杀伤因素刺激下,肿瘤细胞具有不同的响应方式,从而导致它们在细胞增殖、侵袭转移及耐药能力等方面产生差别,尤其是一部分具有转移能力的肿瘤细胞能脱离原位组织并在远处器官形成转移灶。因此,肿瘤细胞的异质性为其发生转移和耐药提供了可能。传统的肿瘤异质性研究主要基于不同位置原位组织样本中的群体细胞,缺乏单细胞层面的解析,尤其是对具有转移能力的肿瘤细胞的异质性研究。本研究建立了基于肺癌恶性胸腔积液中转移性肿瘤细胞的单细胞研究路线,首先利用代谢标志物鉴定恶性胸腔积液中高代谢活性的肿瘤细胞,其次通过单细胞Sanger测序揭示这些肿瘤细胞具有一致的驱动基因突变特征,然后利用高通量测序技术对肿瘤细胞染色体拷贝数变异进行分析,从而揭示同一患者具有转移能力的肿瘤细胞即使具有相同的驱动基因突变特征,但在基因组层面上仍具有异质性,可进一步细分为若干子群。本研究结果对于更深入地理解肿瘤转移机制具有重要意义。

随着干细胞研究的不断深入,干细胞功能分化研究和临床应用转化的需求日益提升。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)来源广泛,不仅自我更新能力强、能够分化成多种类型的成体细胞,而且其自身具有免疫调节能力,不易引发免疫排斥反应,在干细胞功能分化研究和临床应用中具有巨大应用前景和应用潜力。目前,传统的细胞培养方式培养效率低、细胞活性较差,不能满足日益增长的研究和应用需求。本研究利用微载体结合旋转瓶的悬浮培养方法,通过优化细胞接种量及转速等影响因素,快速获得大量高质量的人脐带间充质干细胞。经悬浮培养总细胞量可高达到7×10 ⁸个细胞/L,而且细胞活性较高,MSC 特异性标记物表达良好,在恢复平面培养后仍能维持MSC的正常细胞形态和增殖能力。高效脐带间充质干细胞悬浮培养体系的初步建立,为未来的干细胞功能分化研究和临床应用奠定了基础。

染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)是一种通过对染色体进行全基因组扫描来筛查染色体数目和结构异常的检测技术,是儿科和产前遗传诊断的常规工具,已被应用于流产病因分析。本研究应用CMA技术在全基因组水平分析引起流产的染色体异常情况,并评估该技术在临床流产中的应用价值。对收集的2600例流产样本进行CMA技术检测,成功检测了2505例,成功率高达96.3%,其中1021例用CytoScan Optima芯片进行检测,1211例用CytoScan 750K芯片进行检测,273例用CytoScan HD芯片进行检测。利用这3种芯片共检出967例(38.60%)样本发生染色体异常,其中通过CytoScan Optima芯片检出506例(50.00%),CytoScan 750K芯片检出388例(32.00%),CytoScan HD芯片检出73例(26.74%)。在967例染色体异常中,有801例(82.83%)发生染色体数目异常,94例(9.72%)发生染色体结构异常,56例(5.79%)发生嵌合体,16例(1.65%)检出纯合区域。本研究结果表明,CMA可应用于临床流产物的遗传学诊断,是一种可靠、稳定、高分辨的技术,其检测结果能够对再生育风险评估提供指导。

伊立替康(irinotecan)不良反应与UGT1A1*6单核苷酸多态性相关,目前应用的单核苷酸多态性检测方法具有耗时长、开盖易污染、操作繁琐等缺点,因此需建立一种操作简便且不易污染的适合临床应用的新方法。本研究利用3种已知基因型的DNA样本建立基于级联核酸侵入反应的real-time PCR法检测UGT1A1*6多态性的最佳反应体系,并对其检测口腔咽拭子样本的灵敏度和准确性进行了考察。结果显示,本文成功建立了基于级联核酸侵入反应的UGT1A1*6基因多态性检测方法,可用于咽拭子样本的分型检测,其灵敏度达到6 ng DNA,分型准确性达到100%。因其取样方便对人体无创,单管闭管检测不易产生交叉污染,具有用于临床检测伊立替康的个体化用药相关UGT1A1*6基因多态性的潜力。

T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定非常重要,但是目前常用的方法如反向PCR、半随机引物PCR等,除了操作复杂、消耗时间长外,特异性较差,效率也很低。本研究利用全基因组重测序技术,将3份转基因材料基因组DNA打包后进行重测序,利用转基因载体序列作为参考序列进行比对分析,得到4个T-DNA插入位点。对3份转基因材料进行PCR和Southern blot验证分析,成功获得了3份转基因材料全部T-DNA插入位点,其中1份材料为2拷贝插入。本文利用重测序技术建立了一种简单、可靠、高效的获取转基因植物T-DNA插入位点的方法,以期为植物功能基因组学及转基因研究奠定基础。

为比较稀有变异遗传关联研究中常用负担检验方法(CMC、WST、SUM及其扩展)在不同遗传情境下的统计性能,本文通过计算机模拟产生不同样本量、连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)参数、混杂非关联变异的个数和不同效应的关联变异等条件的稀有变异病例对照数据集,运用各种负担检验方法进行分析,分别计算各方法的一类错误和效能。结果表明,各方法一类错误均在0.05附近;当稀有变异效应方向一致时,除aSUM法外,LD参数越大、混杂非关联变异越少、各法效能越高;当效应方向不一致时,各法效能则显著降低。除强LD外,有方向考虑的方法效能均比无方向考虑的方法高,且样本量越大效能越高。负担检验的统计性能受效应大小和方向、噪音变异和连锁不平衡等多种因素影响。在实际应用中,在各类方法选择、确定集合单位,权重等时最好结合遗传变异的生物信息先验以提高研究效能。

为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector? 2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM^? 830、NEPA 21和Nucleofector? 2b中的转染效率。结果显示：NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10%;Nucleofector? 2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率。ECM^? 830和Nucleofector? 2b的最适质粒用量都为10 μg,而NEPA 21为8 μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中Nucleofector? 2b转染效果最佳。本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础。

Hi-C(highest-throughput chromosome conformation capture)技术是近年出现的一种研究染色质相互作用的关键技术。该技术步骤多、耗时长,涉及的试剂耗材繁杂,目前常规流程还有较多可以改进优化的步骤。本研究以GM12878细胞为材料,通过优化常规Hi-C实验中的交联、酶切、限制性内切酶的失活、末端生物素标记、原位连接等关键步骤,建立了稳健的Hi-C流程,制备了相应的Hi-C文库。文库经初步的Sanger测序等质量控制以后,两个生物学重复文库进行了高通量测序。测序结果利用生物信息学处理发现：原始测序数据中可比对率和配对率分别达到90%和72%左右。此外,去除自连片段(self-circular ligation)和dangling-ends片段以后,可获得超过96%的有效相互作用对,其中染色体内相互作用数据达到60%。进一步的染色体相互作用热图分析可见清晰拓扑学相关结构域TADs(topologically associated domains),与已发表的文献报道一致。而两次生物学重复之间的相关性分析则表明bin coverage和all bin pairs的相关性都极强。上述结果表明通过对常规Hi-C流程关键步骤的优化,本研究建立了高效、稳健、可靠的Hi-C流程,对Hi-C技术的进一步使用与推广具有重要的参考价值。

从单细胞尺度进行细胞异质性的分析是深度理解细胞群体关系的关键。组织中的单细胞由于细胞类型不同,尺寸往往相差很大,但是目前常用的基于微孔板和Fluidigm公司的微流控的单细胞组学研究方法,需要入口的单细胞大小相近。本研究以胃组织为例,建立了一种组织单细胞的基因变异分析方法,实现了尺寸差异较大的单细胞的基因变异分析。在该方法中,先将胃组织裂解获得单个腺体,再将单个腺体酶解得到不同大小的腺体内单细胞,然后把这些单细胞铺在聚乙烯萘膜载玻片上,进行激光显微切割分选、全基因组放大,最后测其微卫星的长度。利用该方法,成功在肠上皮化生腺体内部检测到微卫星长度的变化,并灵活地对尺寸差异大的组织细胞以及肠化生腺体细胞进行了精细分析。此外,这种单细胞分析方法还可以对带有不同标记的细胞进行低通量和高通量的基因组分析,为单细胞尺度上的组织异质性研究提供了一种高度灵活的分析方法。

在核酸检测领域急需一种能够经济、快速、操作简便且同时检测多个靶标的新技术。常规多重PCR能够同时扩增多个靶标,但由于在一个试管中引物间的相互作用和竞争,重数往往受到限制。本研究设计了一种操作简单的多重PCR芯片,可以同时进行54个靶标的扩增。芯片结构简单,一条微通道将正下方平行排列的多个微孔连接在一起,微通道只留加样口和出样口。同时整个微通道呈疏水状态,微孔呈亲水状态。将不同的引物对和低溶点琼脂糖提前固定于不同的微孔中,通过一次加入PCR mix,并加入矿物油推动PCR mix进入到每个微腔室中,同时微孔也被矿物油相互隔离避免交叉反应。加样后将芯片放置于平板PCR仪上进行扩增,在整个反应过程中低溶点琼脂糖呈液态,反应结束后凝固成固体,便可引入核酸染料进行染色,最后利用自制小型的紫外照射仪上进行可视化检测和拍照记录。利用此平台成功实现了对7种非常重要和常用的转基因作物靶标的并行检测,结果显示此平台具有较高的灵活性和特异性。此技术经过进一步优化可应用于包括转基因检测在内的多重核酸检测领域。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是从肿瘤病灶脱落并进入外周血液循环的处于游离状态的肿瘤细胞,代表了肿瘤病灶的分子特征,可用于对肿瘤的“液体活检”。但外周血中CTCs数目极为稀少,使得后续针对CTCs的分子与功能分析面临巨大挑战。鉴于此,本文建立了一种基于微流控芯片和免疫磁珠的能够快速从肺癌患者的外周血中分离CTCs的方法。该方法直接针对全血进行一步分离,可避免血液样本预处理及富集等过程对细胞造成的损伤,从而有效地保护CTCs的活性(>90%)。分离得到的CTCs可富集在小体积中(80 μL),实现高密度的细胞培养,完成体外扩增,扩增后的CTCs可以被进一步冻存、复苏及再次增殖培养,表明已经对患者血液中的CTCs成功建系。本文进一步对CTCs进行了基因突变(EGFR、KRAS、PIK3CA、TP53和BRAF)检测及荧光标记葡萄糖类似物(2-NBDG)摄取的功能分析,证明CTCs存在较大异质性。本研究成功实现了对外周血中稀少的CTCs进行体外培养,并对CTCs进行了基因、蛋白、功能等各个层面的分析,这对于肿瘤精准医疗具有重要的临床意义。

人类学中常将人群分为东亚黄种人、欧洲白种人和非洲黑种人。27-plex SNP种族推断体系可针对来自东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群的样本进行分型检测进而推断其祖先来源。本研究对该体系获取样本分型后的种族推断分析方法进行了进一步优化,建立了一种基于似然比、祖先成分和种族归类的推断分析方法,并对4个来自东亚、欧洲、非洲及其混合人群的测试样本进行种族来源推断。使用基础参考数据库交叉验证和1010份测试样本验证两种方式进行了种族推断方法流程的评估研究。验证结果表明该方法体系在东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群中的推断准确性均高于99%。本种族推断方法可对DNA来源人的种族信息进行刻画,在人类分子遗传学、法医遗传学等领域有重要的应用价值。

线粒体基因组突变会引发多种线粒体遗传疾病。永生淋巴细胞系和转线粒体细胞系是线粒体遗传疾病研究的重要工具之一。永生淋巴细胞系使特殊遗传信息在细胞水平得以永久保存。转线粒体细胞系技术的发展为线粒体遗传疾病的分子机制研究提供了体外细胞平台。早期转线粒体细胞系的胞质供体直接来源于未进行永生化的患者各组织细胞或血小板。本文结合永生化手段,以线粒体4401A>G为例,详细介绍了从冻存全血构建永生化淋巴细胞,然后再与ρ⁰ 206一起构建转线粒体细胞系的原理、方法和技术路线,并将两种细胞模型的构建归纳为4个步骤：(1)永生淋巴细胞构建;(2)转化;(3)筛选;(4)鉴定。为真实反应线粒体突变的功能,本文对构建的永生淋巴系和转线粒体细胞系的线粒体突变位点、拷贝数以及转线粒体细胞系的细胞核型进行了分析与鉴定,选取了各参数一致的细胞系用于贮存与分析,以减少实验误差对后续突变位点功能研究的影响。两种细胞模型在细胞水平上为诠释线粒体遗传疾病的分子机制发挥了重要作用,但在具体应用中需注意它们的局限性,尤其是组织特异性的线粒体疾病。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂是近年来出现的一类新的抗肿瘤药物,在艾滋病等其他疾病中同样也受到关注。但是在基础和临床研究中,目前还缺乏统一可靠的组蛋白乙酰化水平的检测手段。本文利用全血和外周血单个核细胞,通过一系列的对比实验,比较了不同样品处理温度(冰上和室温)、破膜方法(细胞内因子染色破膜和核内因子染色破膜)、抗体剂量(抗体滴定)和抗体孵育时间(时间梯度)等实验条件对流式细胞术检测的影响,最终建立了一套基于流式细胞术的组蛋白乙酰化水平检测手段。同时,将优化后的流式细胞检测技术应用于西达本胺(目前国内唯一上市的组蛋白去乙酰化酶抑制剂)的体外实验和临床试验,结果均证明本文建立的组蛋白乙酰化流式细胞检测方法可以作为基础和临床研究中一个可靠、快速、便捷的检测手段。

乙肝病毒(HBV)是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA(cccDNA)持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个cccDNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用FokⅠ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建FokⅠ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基(-NH₂)修饰的锁核酸与N端巯基(-SH)修饰的FokⅠ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。

传统的DNA重组方法Type Ⅱ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction, TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板——Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是从肿瘤原发病灶脱落并侵入外周血循环的肿瘤细胞。由于CTCs存在较大的异质性,其与癌症发展转移密切相关,但目前尚缺乏有效的CTCs单细胞异质性检测方法。鉴于此,本文发展了在单细胞层面对CTCs进行基因突变的检测方法并用于单个肺癌CTC的EGFR（Epidermal growth factor receptor）基因突变检测。首先用集成式微流控系统完成血液中稀有CTCs的捕获,接着将CTCs释放入含有多个微孔的微阵列芯片中,得到含有单个CTC的微孔,通过显微操作将单个CTC转入PCR管内完成单细胞基因组的放大,并进行单细胞的EGFR基因突变检测。以非小细胞肺癌细胞系A549、NCI-H1650和NCI-H1975为样本,通过芯片与毛细管修饰、引物扩增条件（复性温度、循环次数）的优化,结果显示在复性温度59℃、30个循环次数的条件下,引物扩增效果最优。利用该方法成功地对非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的血液样本进行了测试。从患者2 mL血液中获取5个CTCs,分别对其EGFR基因的第18、19、20、21外显子进行测序,发现该患者CTCs均为EGFR野生型。研究结果证明此检测方法可以灵敏地用于单个CTC基因突变的检测,在临床研究上具有重要的指导意义。

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。

报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用mRFP-eGFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术是新一代功能强大的基因修饰技术。然而,脱靶效应(Off-target effects)是目前CRISPR/Cas9技术面临的最大问题。因此,设计脱靶风险低的sgRNA(single guide RNA)就成为关键。sgRNAcas9是一款专门用于sgRNA设计和评估脱靶效应的软件包。针对其核心运行程序,我们利用Java程序语言开发了其图形用户界面。此外,依据脱靶位点碱基数和sgRNA种子序列(seed sequences)的特异性,通过设置不同的风险等级对sgRNA的脱靶效应进行评估。随后,利用此软件设计了34 124条靶向人、小鼠、大鼠、猪和鸡中共4691个microRNA(miRNA)前体的sgRNAs。此外,随机挑选了一个靶向人miR-206前体的sgRNA进行脱靶效应评估和验证。结果发现,sgRNAcas9软件人机交互界面友好,大多数miRNA前体可通过该软件寻找到sgRNA,且他们的GC%含量范围集中于40%~60%。利用sgRNAcas9软件设计的靶向miR-206的sgRNA,其基因组编辑活性和脱靶位点可被实验验证。本研究表明sgRNAcas9图形用户界面软件能针对任意物种设计特异性的sgRNA,其可在BiooTools(http://www.biootools.com/)网站下载。

为建立一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法,以两组不同的TaqMan qPCR检测梯度稀释的重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品,建立转化与未转化的DNA Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。使用相同的探针定量检测重亚硫酸盐处理后的DNA样本评估转化效率。结果显示该方法应用两组探针,根据相应的标准曲线,精确评估样本经重亚硫酸盐处理的转化效率。使用已知转化和未转化拷贝数的混合DNA作为模板,证实了该方法的可靠性。同时也对不同重亚硫酸盐试剂盒处理DNA的转化效率进行了评估,结果显示,该方法能够有效地评估DNA样品重亚硫酸盐的转化效率,为DNA甲基化准确分析提供了可靠快捷的方法。

遗传图谱表现形式简洁明了,为分析遗传规律、克隆基因提供了便利。Gbrowse、MapViewer等工具虽然能够协助研究人员绘制相似形式的物理图谱,但有很大的局限性：(1)数据需提前布置好;(2)输出结果无法灵活修改。鉴于此,文章基于Perl和SVG语言,开发了一款生物辅助作图软件MapGene2Chrom的本地版与网页版,该软件能够依据输入数据快速绘制相应的物理图谱。该软件输入数据格式简单,输出结果易于修改,图片格式为SVG矢量图,具有很好的移植性,以期为研究人员绘制物理图谱提供便利。

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)大多数在儿童或婴幼儿期发病,表现为进行性、对称性的肢体无力和肌肉萎缩,迄今尚无有效的治疗方法,是婴幼儿最常见的致死性遗传病之一。患者来源的细胞系是该病研究的重要工具,但依赖于肌肉或皮肤活检等创伤性手术的成纤维细胞培养较难被患者及家属接受。文章收集SMA患者及健康对照的新鲜尿液,进行离心、尿液沉渣培养,观察尿液细胞的生长状况,用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析患者尿液细胞中SMN(Survival of motor neuron)蛋白的表达量,应用免疫荧光染色观察SMN蛋白在细胞内的定位。共建立了11例SMA患者和14例健康对照的尿液细胞系,尿液细胞体外增殖旺盛,细胞形态及生长速度较稳定。患者来源的尿液细胞SMN1(Survival of motor neuron 1) 基因缺失突变、SMN蛋白表达量降低,荧光染色提示SMN蛋白在胞浆和胞核中均有定位。尿液细胞培养步骤简单、无创伤性、患儿及其家属的依从性好,是获取和保存病人来源标本的有效方法,在脊髓性肌萎缩症发病机制研究和临床应用方面具有较好的应用价值。