技术与方法 栏目所有文章列表(按年度、期号倒序)
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基于核质遗传原理建立多重PCR检测方法鉴定阿胶中马、驴源性成分及皮张种源
谌阳 王文君 付明 徐国强 周翔 刘榜
遗传    DOI: 10.16288/j.yczz.20-108
录用日期: 2020-09-16

基于单细胞靶向测序探究基因碱基突变的方法
赵利楠, 王娜, 杨国良, 苏现斌, 韩泽广
遗传    2020, 42 (7): 703-712.   DOI: 10.16288/j.yczz.20-046
录用日期: 2020-06-15

摘要187)   HTML5)    PDF (1513KB)(138)   

分析基因碱基突变是探究肿瘤细胞克隆演化的研究方法之一。目前,常取组织不同区域的群体细胞测序,基于群体水平的基因碱基突变频率等信息绘制出肿瘤的克隆演化过程。但是,该方法易遗失低频突变,并且组织群体细胞类型不单一,不能代表特定细胞群体的克隆演化过程。本研究以前列腺基底细胞癌(prostate basal cell carcinoma, BCC)为例,建立了一种探究肿瘤单细胞的基因碱基突变方法,实现了基于单细胞基因碱基突变分析肿瘤细胞的克隆演化过程。首先通过HepG2细胞优化了单细胞全基因组扩增方法,其次用Fluidigm公司的微流控芯片捕获BCC单细胞进行全基因组扩增,然后通过外显子组测序获得SCUBE3MST1L基因碱基突变信息。通过单细胞靶向扩增和Sanger测序,成功在BCC单细胞中检测到SCUBE3MST1L基因碱基突变信息。本研究建立的方法为肿瘤细胞的克隆演化研究提供了一种可靠的技术方案。

基于体细胞突变数据库筛选免疫原性结直肠癌高频新抗原的方法
秦丽丽, 李毅坚, 梁兆端, 陈蕾, 李文慧, 陈超, 黄亚灵, 张乐, 刘松明, 邱思, 葛玉萍, 彭文婷, 林欣欣, 张秀清, 董旋, 李波
遗传    2020, 42 (6): 599-612.   DOI: 10.16288/j.yczz.20-032
录用日期: 2020-05-19

摘要227)   HTML3)    PDF (3536KB)(102)   

结直肠癌是世界高发和高致死率的恶性肿瘤。靶向新抗原的免疫治疗已被证实可以诱导癌症患者肿瘤持续消退,但这些特异性新抗原,仅适用于个体精准治疗。随着大量的高频肿瘤基因突变被发现,这些与突变相关的高频新抗原可覆盖更多人群,具有较强的临床意义。然而目前结直肠癌中是否也存在高频新抗原仍不清楚。本研究利用来源于321个结直肠癌患者的体细胞突变数据库,联合1种标准过滤和7种预测算法,筛选并获得了25个基于中国人高频分型HLA-A*1101限制性的高频新抗原,它们均具有高亲和力(IC50<50 nmol/L)和高呈递分值(>0.90);其中,除了阳性对照多肽KRAS_G12V8-16外,11个高频新抗原能够在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)分泌γ干扰素(interferon gamma, IFN-γ),证实具有免疫原性。选取免疫原性最强的新抗原C1orf170_S418G413-421及阳性对照多肽KRAS_G12V8-16体外刺激T细胞,利用流式细胞分选及单细胞转录组测序技术,获得其特异性CTL的免疫组库信息,所构建的TCR-T(T-cell receptor engineered T cell)能够识别新抗原并分泌细胞因子。以上结果表明,本研究开发了一种利用体细胞数据库预测并体外筛选验证具有免疫原性高频新抗原的方法,为结直肠癌及其他癌种的多肽、DC(dendritic cells)疫苗、TCR-like抗体、TCR-T等免疫治疗提供了重要的多肽靶点和TCR信息,具有实际的临床应用价值。

三代测序与靶向捕获技术联用进行高分辨HLA基因分型及MHC区域单倍体型精细鉴定
陈佳,舒明月,里进,付爱思,杨帆,王邹,李一荣,邓子新,刘天罡
遗传    2019, 41 (4): 337-348.   DOI: 10.16288/j.yczz.18-282
录用日期: 2019-02-25

摘要778)   HTML22)    PDF (843KB)(351)   

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)的高分辨率、精准分型对于组织配型以及HLA相关疾病研究具有重要意义。本研究以12位原发性肝细胞癌病人的外周血为供试样本,分析二、三代测序数据用于高分辨率HLA分型的优劣势,同时结合探针捕获与三代测序技术对YH、HeLa标准细胞系以及一个原发性肝细胞癌病人的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)区域进行靶向分析,探究长读长测序技术对于整个MHC区域精细分析的潜力。研究表明:(1)二、三代测序技术均能实现6~8位高分辨HLA分型,且两者分型结果一致。但是三代数据的覆盖均一度显著优于二代,不会出现明显的“断层”现象;(2)超长的三代数据可直接跨越整个扩增子,对于基因单倍体型的判定(phasing)具有明显优势。样本中92.79%的HLA基因能够得到准确的单倍体分型结果,远高于二代的75.65%;(3)长读长的三代测序数据不但能实现对MHC区域的更好组装,还具有对整个MHC共计3.6 Mb区域进行phasing的能力,而这将有助于明确各个突变位点、等位基因、非编码区等基因原件在每个MHC单倍体型上的定位与相互连锁信息,为免疫等相关疾病的研究提供理论依据。

肺癌恶性胸腔积液中稀有肿瘤细胞的鉴定与单细胞测序分析
吴保军,王卓,董宇,邓宇亮,施奇惠
遗传    2019, 41 (2): 175-184.   DOI: 10.16288/j.yczz.18-230
录用日期: 2019-01-14

摘要551)   HTML6)    PDF (642KB)(183)   

肿瘤细胞的异质性是指肿瘤细胞在基因组或表型水平上具有不同特征。在外界环境压力或人为杀伤因素刺激下,肿瘤细胞具有不同的响应方式,从而导致它们在细胞增殖、侵袭转移及耐药能力等方面产生差别,尤其是一部分具有转移能力的肿瘤细胞能脱离原位组织并在远处器官形成转移灶。因此,肿瘤细胞的异质性为其发生转移和耐药提供了可能。传统的肿瘤异质性研究主要基于不同位置原位组织样本中的群体细胞,缺乏单细胞层面的解析,尤其是对具有转移能力的肿瘤细胞的异质性研究。本研究建立了基于肺癌恶性胸腔积液中转移性肿瘤细胞的单细胞研究路线,首先利用代谢标志物鉴定恶性胸腔积液中高代谢活性的肿瘤细胞,其次通过单细胞Sanger测序揭示这些肿瘤细胞具有一致的驱动基因突变特征,然后利用高通量测序技术对肿瘤细胞染色体拷贝数变异进行分析,从而揭示同一患者具有转移能力的肿瘤细胞即使具有相同的驱动基因突变特征,但在基因组层面上仍具有异质性,可进一步细分为若干子群。本研究结果对于更深入地理解肿瘤转移机制具有重要意义。

利用微载体悬浮培养人脐带间充质干细胞
李夏, 滑慧娟, 郝捷, 王柳, 刘忠华
遗传    2018, 40 (12): 1120-1128.   DOI: 10.16288/j.yczz.18-123
录用日期: 2018-09-04

摘要568)   HTML6)    PDF (770KB)(264)   

随着干细胞研究的不断深入,干细胞功能分化研究和临床应用转化的需求日益提升。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)来源广泛,不仅自我更新能力强、能够分化成多种类型的成体细胞,而且其自身具有免疫调节能力,不易引发免疫排斥反应,在干细胞功能分化研究和临床应用中具有巨大应用前景和应用潜力。目前,传统的细胞培养方式培养效率低、细胞活性较差,不能满足日益增长的研究和应用需求。本研究利用微载体结合旋转瓶的悬浮培养方法,通过优化细胞接种量及转速等影响因素,快速获得大量高质量的人脐带间充质干细胞。经悬浮培养总细胞量可高达到7×10 8个细胞/L,而且细胞活性较高,MSC 特异性标记物表达良好,在恢复平面培养后仍能维持MSC的正常细胞形态和增殖能力。高效脐带间充质干细胞悬浮培养体系的初步建立,为未来的干细胞功能分化研究和临床应用奠定了基础。

染色体微阵列分析技术在2600例流产物中的应用
彭继苹, 袁海明
遗传    2018, 40 (9): 779-788.   DOI: 10.16288/j.yczz.18-120
录用日期: 2018-08-03

摘要893)   HTML7)    PDF (343KB)(583)   

染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)是一种通过对染色体进行全基因组扫描来筛查染色体数目和结构异常的检测技术,是儿科和产前遗传诊断的常规工具,已被应用于流产病因分析。本研究应用CMA技术在全基因组水平分析引起流产的染色体异常情况,并评估该技术在临床流产中的应用价值。对收集的2600例流产样本进行CMA技术检测,成功检测了2505例,成功率高达96.3%,其中1021例用CytoScan Optima芯片进行检测,1211例用CytoScan 750K芯片进行检测,273例用CytoScan HD芯片进行检测。利用这3种芯片共检出967例(38.60%)样本发生染色体异常,其中通过CytoScan Optima芯片检出506例(50.00%),CytoScan 750K芯片检出388例(32.00%),CytoScan HD芯片检出73例(26.74%)。在967例染色体异常中,有801例(82.83%)发生染色体数目异常,94例(9.72%)发生染色体结构异常,56例(5.79%)发生嵌合体,16例(1.65%)检出纯合区域。本研究结果表明,CMA可应用于临床流产物的遗传学诊断,是一种可靠、稳定、高分辨的技术,其检测结果能够对再生育风险评估提供指导。

基于级联核酸侵入反应的real-time PCR法检测咽拭子样本中UGT1A1*6基因多态性
张婕妤,初亚男,邹秉杰,张晏洁,封利颖
遗传    2018, 40 (8): 668-675.   DOI: 10.16288/j.yczz.18-074
录用日期: 2018-05-31

摘要505)   HTML3)    PDF (680KB)(168)   

伊立替康(irinotecan)不良反应与UGT1A1*6单核苷酸多态性相关,目前应用的单核苷酸多态性检测方法具有耗时长、开盖易污染、操作繁琐等缺点,因此需建立一种操作简便且不易污染的适合临床应用的新方法。本研究利用3种已知基因型的DNA样本建立基于级联核酸侵入反应的real-time PCR法检测UGT1A1*6多态性的最佳反应体系,并对其检测口腔咽拭子样本的灵敏度和准确性进行了考察。结果显示,本文成功建立了基于级联核酸侵入反应的UGT1A1*6基因多态性检测方法,可用于咽拭子样本的分型检测,其灵敏度达到6 ng DNA,分型准确性达到100%。因其取样方便对人体无创,单管闭管检测不易产生交叉污染,具有用于临床检测伊立替康的个体化用药相关UGT1A1*6基因多态性的潜力。

利用重测序技术获取转基因植物T-DNA插入位点
徐纪明,胡晗,毛文轩,毛传澡
遗传    2018, 40 (8): 676-682.   DOI: 10.16288/j.yczz.18-080
录用日期: 2018-07-26

摘要707)   HTML17)    PDF (724KB)(439)   

T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定非常重要,但是目前常用的方法如反向PCR、半随机引物PCR等,除了操作复杂、消耗时间长外,特异性较差,效率也很低。本研究利用全基因组重测序技术,将3份转基因材料基因组DNA打包后进行重测序,利用转基因载体序列作为参考序列进行比对分析,得到4个T-DNA插入位点。对3份转基因材料进行PCR和Southern blot验证分析,成功获得了3份转基因材料全部T-DNA插入位点,其中1份材料为2拷贝插入。本文利用重测序技术建立了一种简单、可靠、高效的获取转基因植物T-DNA插入位点的方法,以期为植物功能基因组学及转基因研究奠定基础。

稀有变异遗传关联性研究中常用负担检验方法比较
林欣琪,梁融,张俊国,皮路程,陈思东,刘丽,郜艳晖
遗传    2018, 40 (2): 162-169.   DOI: 10.16288/j.yczz.17-174
录用日期: 2018-02-01

摘要343)   HTML20)    PDF (445KB)(260)   

为比较稀有变异遗传关联研究中常用负担检验方法(CMC、WST、SUM及其扩展)在不同遗传情境下的统计性能,本文通过计算机模拟产生不同样本量、连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)参数、混杂非关联变异的个数和不同效应的关联变异等条件的稀有变异病例对照数据集,运用各种负担检验方法进行分析,分别计算各方法的一类错误和效能。结果表明,各方法一类错误均在0.05附近;当稀有变异效应方向一致时,除aSUM法外,LD参数越大、混杂非关联变异越少、各法效能越高;当效应方向不一致时,各法效能则显著降低。除强LD外,有方向考虑的方法效能均比无方向考虑的方法高,且样本量越大效能越高。负担检验的统计性能受效应大小和方向、噪音变异和连锁不平衡等多种因素影响。在实际应用中,在各类方法选择、确定集合单位,权重等时最好结合遗传变异的生物信息先验以提高研究效能。

不同电转仪的电转参数、质粒用量和拓扑结构对猪胎儿成纤维细胞转染效率的影响
钟翠丽, 李国玲, 莫健新, 全绒, 王豪强, 李紫聪, 吴珍芳, 张献伟
遗传    2017, 39 (10): 930-938.   DOI: 10.16288/j.yczz.17-080
摘要534)   HTML6)    PDF (971KB)(872)   

为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector? 2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM? 830、NEPA 21和Nucleofector? 2b中的转染效率。结果显示:NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10%;Nucleofector? 2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率。ECM? 830和Nucleofector? 2b的最适质粒用量都为10 μg,而NEPA 21为8 μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中Nucleofector? 2b转染效果最佳。本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础。

被引次数: Baidu(1)
全基因组染色质相互作用Hi-C文库制备的优化及其质量控制
张香媛,何超,叶丙雨,谢德健,师明磊,张彦,沈文龙,李平,赵志虎
遗传    2017, 39 (9): 847-855.   DOI: 10.16288/j.yczz.17-152
摘要660)   HTML17)    PDF (765KB)(1547)   

Hi-C(highest-throughput chromosome conformation capture)技术是近年出现的一种研究染色质相互作用的关键技术。该技术步骤多、耗时长,涉及的试剂耗材繁杂,目前常规流程还有较多可以改进优化的步骤。本研究以GM12878细胞为材料,通过优化常规Hi-C实验中的交联、酶切、限制性内切酶的失活、末端生物素标记、原位连接等关键步骤,建立了稳健的Hi-C流程,制备了相应的Hi-C文库。文库经初步的Sanger测序等质量控制以后,两个生物学重复文库进行了高通量测序。测序结果利用生物信息学处理发现:原始测序数据中可比对率和配对率分别达到90%和72%左右。此外,去除自连片段(self-circular ligation)和dangling-ends片段以后,可获得超过96%的有效相互作用对,其中染色体内相互作用数据达到60%。进一步的染色体相互作用热图分析可见清晰拓扑学相关结构域TADs(topologically associated domains),与已发表的文献报道一致。而两次生物学重复之间的相关性分析则表明bin coverage和all bin pairs的相关性都极强。上述结果表明通过对常规Hi-C流程关键步骤的优化,本研究建立了高效、稳健、可靠的Hi-C流程,对Hi-C技术的进一步使用与推广具有重要的参考价值。

被引次数: Baidu(1)
组织单腺体内单细胞的基因变异分析方法
周彦, 王超杰, 朱纯超, 陈江荣, 程酩, 邓宇亮, 郭妍
遗传    2017, 39 (8): 753-762.   DOI: 10.16288/j.yczz.17-057
摘要596)   HTML1)    PDF (1059KB)(339)   

从单细胞尺度进行细胞异质性的分析是深度理解细胞群体关系的关键。组织中的单细胞由于细胞类型不同,尺寸往往相差很大,但是目前常用的基于微孔板和Fluidigm公司的微流控的单细胞组学研究方法,需要入口的单细胞大小相近。本研究以胃组织为例,建立了一种组织单细胞的基因变异分析方法,实现了尺寸差异较大的单细胞的基因变异分析。在该方法中,先将胃组织裂解获得单个腺体,再将单个腺体酶解得到不同大小的腺体内单细胞,然后把这些单细胞铺在聚乙烯萘膜载玻片上,进行激光显微切割分选、全基因组放大,最后测其微卫星的长度。利用该方法,成功在肠上皮化生腺体内部检测到微卫星长度的变化,并灵活地对尺寸差异大的组织细胞以及肠化生腺体细胞进行了精细分析。此外,这种单细胞分析方法还可以对带有不同标记的细胞进行低通量和高通量的基因组分析,为单细胞尺度上的组织异质性研究提供了一种高度灵活的分析方法。

一种载样简单的多重可视化PCR微芯片
陈建伟,邵宁,张雨晨,朱元首,杨立桃,陶生策,卢大儒
遗传    2017, 39 (6): 525-534.   DOI: 10.16288/j.yczz.17-031
摘要605)   HTML4)    PDF (634KB)(1013)   

在核酸检测领域急需一种能够经济、快速、操作简便且同时检测多个靶标的新技术。常规多重PCR能够同时扩增多个靶标,但由于在一个试管中引物间的相互作用和竞争,重数往往受到限制。本研究设计了一种操作简单的多重PCR芯片,可以同时进行54个靶标的扩增。芯片结构简单,一条微通道将正下方平行排列的多个微孔连接在一起,微通道只留加样口和出样口。同时整个微通道呈疏水状态,微孔呈亲水状态。将不同的引物对和低溶点琼脂糖提前固定于不同的微孔中,通过一次加入PCR mix,并加入矿物油推动PCR mix进入到每个微腔室中,同时微孔也被矿物油相互隔离避免交叉反应。加样后将芯片放置于平板PCR仪上进行扩增,在整个反应过程中低溶点琼脂糖呈液态,反应结束后凝固成固体,便可引入核酸染料进行染色,最后利用自制小型的紫外照射仪上进行可视化检测和拍照记录。利用此平台成功实现了对7种非常重要和常用的转基因作物靶标的并行检测,结果显示此平台具有较高的灵活性和特异性。此技术经过进一步优化可应用于包括转基因检测在内的多重核酸检测领域。

肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的快速分离与体外培养
吴文君, 王智华, 王卓, 邓宇亮, 施奇惠
遗传    2017, 39 (1): 66-74.   DOI: 10.16288/j.yczz.16-217
摘要728)   HTML7)    PDF (612KB)(942)   

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是从肿瘤病灶脱落并进入外周血液循环的处于游离状态的肿瘤细胞,代表了肿瘤病灶的分子特征,可用于对肿瘤的“液体活检”。但外周血中CTCs数目极为稀少,使得后续针对CTCs的分子与功能分析面临巨大挑战。鉴于此,本文建立了一种基于微流控芯片和免疫磁珠的能够快速从肺癌患者的外周血中分离CTCs的方法。该方法直接针对全血进行一步分离,可避免血液样本预处理及富集等过程对细胞造成的损伤,从而有效地保护CTCs的活性(>90%)。分离得到的CTCs可富集在小体积中(80 μL),实现高密度的细胞培养,完成体外扩增,扩增后的CTCs可以被进一步冻存、复苏及再次增殖培养,表明已经对患者血液中的CTCs成功建系。本文进一步对CTCs进行了基因突变(EGFR、KRAS、PIK3CA、TP53BRAF)检测及荧光标记葡萄糖类似物(2-NBDG)摄取的功能分析,证明CTCs存在较大异质性。本研究成功实现了对外周血中稀少的CTCs进行体外培养,并对CTCs进行了基因、蛋白、功能等各个层面的分析,这对于肿瘤精准医疗具有重要的临床意义。

被引次数: Baidu(4)
27-plex SNP种族推断方法的优化及验证
江丽,孙启凡,马泉,赵雯婷,刘京,赵蕾,季安全,李彩霞
遗传    2017, 39 (2): 166-173.   DOI: 10.16288/j.yczz.16-346
摘要742)   HTML9)    PDF (670KB)(895)   

人类学中常将人群分为东亚黄种人、欧洲白种人和非洲黑种人。27-plex SNP种族推断体系可针对来自东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群的样本进行分型检测进而推断其祖先来源。本研究对该体系获取样本分型后的种族推断分析方法进行了进一步优化,建立了一种基于似然比、祖先成分和种族归类的推断分析方法,并对4个来自东亚、欧洲、非洲及其混合人群的测试样本进行种族来源推断。使用基础参考数据库交叉验证和1010份测试样本验证两种方式进行了种族推断方法流程的评估研究。验证结果表明该方法体系在东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群中的推断准确性均高于99%。本种族推断方法可对DNA来源人的种族信息进行刻画,在人类分子遗传学、法医遗传学等领域有重要的应用价值。

被引次数: Baidu(6)
线粒体遗传疾病细胞模型的构建:永生淋巴细胞系和转线粒体细胞系
孙吉吉, 赵晓旭, 乔丽华, 梅霜, 聂志鹏, 张青海, 冀延春, 蒋萍萍, 管敏鑫
遗传    2016, 38 (7): 666-673.   DOI: 10.16288/j.yczz.16-085
摘要815)      PDF (2218KB)(801)   
线粒体基因组突变会引发多种线粒体遗传疾病。永生淋巴细胞系和转线粒体细胞系是线粒体遗传疾病研究的重要工具之一。永生淋巴细胞系使特殊遗传信息在细胞水平得以永久保存。转线粒体细胞系技术的发展为线粒体遗传疾病的分子机制研究提供了体外细胞平台。早期转线粒体细胞系的胞质供体直接来源于未进行永生化的患者各组织细胞或血小板。本文结合永生化手段,以线粒体4401A>G为例,详细介绍了从冻存全血构建永生化淋巴细胞,然后再与ρ0 206一起构建转线粒体细胞系的原理、方法和技术路线,并将两种细胞模型的构建归纳为4个步骤:(1)永生淋巴细胞构建;(2)转化;(3)筛选;(4)鉴定。为真实反应线粒体突变的功能,本文对构建的永生淋巴系和转线粒体细胞系的线粒体突变位点、拷贝数以及转线粒体细胞系的细胞核型进行了分析与鉴定,选取了各参数一致的细胞系用于贮存与分析,以减少实验误差对后续突变位点功能研究的影响。两种细胞模型在细胞水平上为诠释线粒体遗传疾病的分子机制发挥了重要作用,但在具体应用中需注意它们的局限性,尤其是组织特异性的线粒体疾病。
被引次数: Baidu(1)
流式细胞术检测组蛋白乙酰化水平方法的建立与应用
李建辉, 汪春付, 白帆, 庄严, 毛卓君, 孙永涛
遗传    2016, 38 (6): 581-587.   DOI: 10.16288/j.yczz.16-065
摘要523)      PDF (1464KB)(991)   
组蛋白去乙酰化酶抑制剂是近年来出现的一类新的抗肿瘤药物,在艾滋病等其他疾病中同样也受到关注。但是在基础和临床研究中,目前还缺乏统一可靠的组蛋白乙酰化水平的检测手段。本文利用全血和外周血单个核细胞,通过一系列的对比实验,比较了不同样品处理温度(冰上和室温)、破膜方法(细胞内因子染色破膜和核内因子染色破膜)、抗体剂量(抗体滴定)和抗体孵育时间(时间梯度)等实验条件对流式细胞术检测的影响,最终建立了一套基于流式细胞术的组蛋白乙酰化水平检测手段。同时,将优化后的流式细胞检测技术应用于西达本胺(目前国内唯一上市的组蛋白去乙酰化酶抑制剂)的体外实验和临床试验,结果均证明本文建立的组蛋白乙酰化流式细胞检测方法可以作为基础和临床研究中一个可靠、快速、便捷的检测手段。
利用锁核酸化学偶联FokⅠ核酸酶靶向切割HBV基因的体外实验
马丽, 陈红岩, 朱化星, 李威, 卢大儒
遗传    2016, 38 (4): 350-359.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-435
摘要585)      PDF (7027KB)(345)   
乙肝病毒(HBV)是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA(cccDNA)持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个cccDNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用FokⅠ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建FokⅠ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基(-NH2)修饰的锁核酸与N端巯基(-SH)修饰的FokⅠ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。
耐热DNA连接酶介导的TLCR技术在简化DNA重组实验中的应用
周翔达,宋晓,怀聪,孙海燕,陈红岩,卢大儒
遗传    2016, 38 (2): 163-169.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-428
摘要661)      PDF (2768KB)(935)   
传统的DNA重组方法Type Ⅱ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction, TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板——Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。
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肺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测
孙帅, 邓宇亮
遗传    2015, 37 (12): 1251-1257.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-130
摘要770)      PDF (1925KB)(1323)   
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)是从肿瘤原发病灶脱落并侵入外周血循环的肿瘤细胞。由于CTCs存在较大的异质性,其与癌症发展转移密切相关,但目前尚缺乏有效的CTCs单细胞异质性检测方法。鉴于此,本文发展了在单细胞层面对CTCs进行基因突变的检测方法并用于单个肺癌CTC的EGFR(Epidermal growth factor receptor)基因突变检测。首先用集成式微流控系统完成血液中稀有CTCs的捕获,接着将CTCs释放入含有多个微孔的微阵列芯片中,得到含有单个CTC的微孔,通过显微操作将单个CTC转入PCR管内完成单细胞基因组的放大,并进行单细胞的EGFR基因突变检测。以非小细胞肺癌细胞系A549、NCI-H1650和NCI-H1975为样本,通过芯片与毛细管修饰、引物扩增条件(复性温度、循环次数)的优化,结果显示在复性温度59℃、30个循环次数的条件下,引物扩增效果最优。利用该方法成功地对非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的血液样本进行了测试。从患者2 mL血液中获取5个CTCs,分别对其EGFR基因的第18、19、20、21外显子进行测序,发现该患者CTCs均为EGFR野生型。研究结果证明此检测方法可以灵敏地用于单个CTC基因突变的检测,在临床研究上具有重要的指导意义。
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利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑
刘改改,李爽,韦余达,张永贤,丁秋蓉
遗传    2015, 37 (11): 1167-1173.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-240
摘要725)      PDF (1781KB)(1899)   
CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑:通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。
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基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用
韩芙蓉, 王令, 徐坤, 张智英, 王昕
遗传    2015, 37 (10): 1053-1060.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-246
摘要574)      PDF (8044KB)(795)   
报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用mRFP-eGFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。
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sgRNAcas9软件图形用户界面开发及应用
赵长志, 张懿, 李广磊, 陈济良, 李京津, 任瑞敏, 倪攀, 赵书红, 谢胜松
遗传    2015, 37 (10): 1061-1072.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-292
摘要1198)      PDF (2044KB)(1262)   
CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术是新一代功能强大的基因修饰技术。然而,脱靶效应(Off-target effects)是目前CRISPR/Cas9技术面临的最大问题。因此,设计脱靶风险低的sgRNA(single guide RNA)就成为关键。sgRNAcas9是一款专门用于sgRNA设计和评估脱靶效应的软件包。针对其核心运行程序,我们利用Java程序语言开发了其图形用户界面。此外,依据脱靶位点碱基数和sgRNA种子序列(seed sequences)的特异性,通过设置不同的风险等级对sgRNA的脱靶效应进行评估。随后,利用此软件设计了34 124条靶向人、小鼠、大鼠、猪和鸡中共4691个microRNA(miRNA)前体的sgRNAs。此外,随机挑选了一个靶向人miR-206前体的sgRNA进行脱靶效应评估和验证。结果发现,sgRNAcas9软件人机交互界面友好,大多数miRNA前体可通过该软件寻找到sgRNA,且他们的GC%含量范围集中于40%~60%。利用sgRNAcas9软件设计的靶向miR-206的sgRNA,其基因组编辑活性和脱靶位点可被实验验证。本研究表明sgRNAcas9图形用户界面软件能针对任意物种设计特异性的sgRNA,其可在BiooTools(http://www.biootools.com/)网站下载。
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DNA甲基化分析中重亚硫酸盐处理DNA转化效率的评估方法
刘洋洋, 崔恒宓
遗传    2015, 37 (9): 939-944.   DOI: 10.16288/j.yczz.15-129
摘要888)      PDF (1508KB)(1651)   
为建立一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法,以两组不同的TaqMan qPCR检测梯度稀释的重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品,建立转化与未转化的DNA Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。使用相同的探针定量检测重亚硫酸盐处理后的DNA样本评估转化效率。结果显示该方法应用两组探针,根据相应的标准曲线,精确评估样本经重亚硫酸盐处理的转化效率。使用已知转化和未转化拷贝数的混合DNA作为模板,证实了该方法的可靠性。同时也对不同重亚硫酸盐试剂盒处理DNA的转化效率进行了评估,结果显示,该方法能够有效地评估DNA样品重亚硫酸盐的转化效率,为DNA甲基化准确分析提供了可靠快捷的方法。
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MapGene2Chrom基于Perl和SVG语言绘因物理图谱
晁江涛, 孔英珍, 王倩, 孙玉合, 龚达平, 吕婧, 刘贯山
遗传    2015, 37 (1): 91-97.   DOI: 10.16288/j.yczz.2015.01.013
摘要795)      PDF (2403KB)(2646)   
遗传图谱表现形式简洁明了,为分析遗传规律、克隆基因提供了便利。Gbrowse、MapViewer等工具虽然能够协助研究人员绘制相似形式的物理图谱,但有很大的局限性:(1)数据需提前布置好;(2)输出结果无法灵活修改。鉴于此,文章基于Perl和SVG语言,开发了一款生物辅助作图软件MapGene2Chrom的本地版与网页版,该软件能够依据输入数据快速绘制相应的物理图谱。该软件输入数据格式简单,输出结果易于修改,图片格式为SVG矢量图,具有很好的移植性,以期为研究人员绘制物理图谱提供便利。
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脊髓性肌萎缩症患者尿液细胞模型的建立
陈万金, 张奇杰, 何瑾, 林翔, 王柠
遗传    2014, 36 (11): 1168-1172.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.1168
摘要399)      PDF (1740KB)(1096)   
脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)大多数在儿童或婴幼儿期发病,表现为进行性、对称性的肢体无力和肌肉萎缩,迄今尚无有效的治疗方法,是婴幼儿最常见的致死性遗传病之一。患者来源的细胞系是该病研究的重要工具,但依赖于肌肉或皮肤活检等创伤性手术的成纤维细胞培养较难被患者及家属接受。文章收集SMA患者及健康对照的新鲜尿液,进行离心、尿液沉渣培养,观察尿液细胞的生长状况,用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析患者尿液细胞中SMN(Survival of motor neuron)蛋白的表达量,应用免疫荧光染色观察SMN蛋白在细胞内的定位。共建立了11例SMA患者和14例健康对照的尿液细胞系,尿液细胞体外增殖旺盛,细胞形态及生长速度较稳定。患者来源的尿液细胞SMN1(Survival of motor neuron 1) 基因缺失突变、SMN蛋白表达量降低,荧光染色提示SMN蛋白在胞浆和胞核中均有定位。尿液细胞培养步骤简单、无创伤性、患儿及其家属的依从性好,是获取和保存病人来源标本的有效方法,在脊髓性肌萎缩症发病机制研究和临床应用方面具有较好的应用价值。
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活体电转化技术在新生小鼠视网膜中的应用
肖丽容, 陈大年, 闫乃红
遗传    2014, 36 (11): 1173-1178.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.1173
摘要458)      PDF (2131KB)(900)   
活体电转化技术是在高电压的脉冲作用下,瞬态增加细胞膜的渗透性从而将外源基因高效导入细胞的方法。与病毒载体等其他方法相比,活体电转化技术具有安全、高效、快速、稳定及应用范围广等优点,近年来在很多组织和器官中得到广泛使用,包括在眼科研究领域。文章介绍了活体电转化技术在新生小鼠视网膜中的应用,通过新生小鼠视网膜下注射的方法,经几次高电压的脉冲,将高浓度的绿色荧光蛋白表达质粒导入新生小鼠视网膜细胞内。通过冰冻切片观察绿色荧光蛋白在视网膜中的表达。结果表明绿色荧光蛋白在视网膜外核层高表达,证实了活体电转化技术可以将外源基因高效、快捷的导入视网膜,从而为研究视网膜发育及功能提供一种有效的手段。
被引次数: Baidu(1)
一种基于高密度遗传标记的亲子鉴定方法及其应用
张哲, 罗元宇, 李晴晴, 贺金龙, 高宁, 张豪, 丁向东, 张勤, 李加琪
遗传    2014, 36 (8): 835-841.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0835
摘要591)      PDF (300KB)(1254)   
系谱是人类遗传及动植物育种研究与实践的重要信息来源之一。系谱记录错误是育种生产中普遍存在的一种记录错误,影响基因定位、遗传值及表型值预测等相关研究结果的可靠性。现有的方法软件可以利用遗传标记信息对疑似亲子进行亲子鉴定,但这些软件方法操作复杂,限制标记数量,如Cervus。针对当前高密度SNP标记在人类及动植物研究中广泛应用的现状,文章提出了一种基于全基因组高密度SNP数据的亲子鉴定新方法,命名为EasyPC。对EasyPC及Cervus的运行效率进行了对比,并用中国荷斯坦牛(n=2180)和杜洛克猪(n=191)的全基因组SNP芯片数据对EasyPC进行了验证。结果表明:EasyPC运行效率高于Cervus,牛和猪群体系谱错误率分别为20%和6%,与相关研究报道相符。通过使用全基因组SNP标记对群体孟德尔错误率的经验分布进行分析,该方法不仅可以简单、快速、准确地判别系谱的正确性,而且还可以对错误系谱进行校正。EasyPC为解决全基因组研究中基因型及系谱数据前处理过程中的系谱校正问题提供了一种新的途径。
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基因组二代测序数据的自动化分析流程
李文轲, 李丰余, 张思瑶, 蔡斌, 郑娜, 聂宇, 周到, 赵倩
遗传    2014, 36 (6): 618-624.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0618
摘要1303)      PDF (500KB)(6736)   

二代测序技术的发展对测序数据的处理分析提出了很高的要求。目前二代测序数据分析软件很多, 但是绝大多数软件仅能完成单一的分析功能(例如:仅进行序列比对或变异读取或功能注释等), 如何能正确高效地选择整合这些软件已成为迫切需求。文章设计了一套基于perl语言和SGE资源管理的自动化处理流程来分析Illumina平台基因组测序数据。该流程以测序原始序列数据作为输入, 调用业界标准的数据处理软件(如:BWA, Samtools, GATK, ANNOVAR等), 最终生成带有相应功能注释、便于研究者进一步分析的变异位点列表。该流程通过自动化并行脚本控制流程的高效运行, 一站式输出分析结果和报告, 简化了数据分析过程中的人工操作, 大大提高了运行效率。用户只需填写配置文件或使用图形界面输入即可完成全部操作。该工作为广大研究者分析二代测序数据提供了便利的途径。

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北京油鸡MSAP毛细管电泳荧光检测技术的建立
李金龙, 唐韶青, 邹智元, 王海潮, 徐青
遗传    2014, 36 (5): 495-502.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0495
摘要551)      PDF (4077KB)(1221)   

采用毛细管电泳荧光检测技术, 对北京油鸡肌肉组织基因组进行甲基化敏感扩增片段多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)检测。通过对基因组DNA用量、预扩产物稀释倍数、选择性引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和电泳内标量等6个主要参数进行分析和优化, 建立了适合北京油鸡基因组DNA甲基化分析的MSAP毛细管电泳荧光检测技术。重复实验表明, 建立的毛细管电泳荧光标记的MSAP检测技术能够自动地、高通量地分析北京油鸡基因组的DNA甲基化状态, 也适用于其他动植物基因组的DNA甲基化研究。

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基于蛋白质互作知识的生物学通路扩充新方法
赵小蕾, 左晓宇, 覃继恒, 梁岩, 张乃尊, 栾奕昭, 饶绍奇
遗传    2014, 36 (4): 387-394.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0387
摘要1020)      PDF (3185KB)(74081)   

生物学通路被广泛应用于基因功能学研究, 但现有的生物学通路知识并不完善, 仍需进一步扩充。生物信息学预测为通路扩充提供了一种有效且经济的途径。文章提出了一种融合蛋白质-蛋白质互作知识以及Gene Ontology(GO)数据库信息进行基因通路预测的新方法。首先选取目标基因在蛋白质-蛋白质互作层面上的邻居所在的Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路为候选通路, 然后通过检验候选通路中的基因是否在与目标基因关联的GO节点富集来判断目标基因的通路归属。分别利用Human Protein Reference Database (HPRD)和Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)数据库中的蛋白质-蛋白质互作信息进行预测。结果表明, 在两套数据中, 随着互作邻居个数的增加, 预测的平均准确率(在所有目标基因注释的通路中被成功预测的比例)及相对准确率(在至少有一个注释通路被成功预测的基因集中, 所有注释通路均被预测正确的基因所占的比例)均呈现上升趋势。当互作邻居个数达到22时, 预测的平均准确率分别达到96.2%(HPRD)和96.3%(BioGRID), 而相对准确率分别为93.3%(HPRD)和84.1%(BioGRID)。进一步利用新版数据库对旧版数据库中被更新的89个基因进行验证, 至少有一个更新通路被预测正确的基因有50个, 其中43个基因的更新通路被完全正确预测, 相对准确率为86.0%。这些结果显示该方法是一种可靠且有效的通路扩充方法。

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利用改进的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因
陈竹锋, 严维, 王娜, 张文辉, 谢刚, 卢嘉威, 简智华, 刘东风, 唐晓艳
遗传    2014, 36 (1): 85-93.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.00085
摘要1489)      PDF (717KB)(2943)   

通过对籼稻黄华占EMS(甲磺酸乙酯)诱变, 筛选得到一隐性核不育的水稻雄性不育突变体osms55, 遗传分析表明该突变体为单基因控制的隐性核不育, 采用高通量的Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片检测技术鉴定该突变体的遗传背景, 确认该突变体的遗传背景与黄华占一致。文章利用改进的MutMap方法成功克隆该雄性不育基因, 突变位点与突变表型的共分离分析表明LOC_Os02g40450(MER3)是控制osms55突变体雄性不育的基因, 该基因的剪切识别位点发生变异后导致剪切异常, 造成第5外显子缺失15个碱基, 从而产生雄性不育。改进的MutMap方法无需精确组装的野生型基因组序列作对照, 而是通过将定位群体中有突变表型植株的DNA pool和野生型植株DNA的重测序结果分别与日本晴参考基因组进行比对, 然后再比较突变体和野生型的差异SNP来确定候选基因, 该方法大大降低了野生型基因组测序和组装成本, 进一步扩大了MutMap方法的应用范围。

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应用HRM技术对CYP2C19*2和CYP2C19*3进行双重SNP分型
曹春鸽 孙海燕 周芳芳 王诗铭 陈红岩 卢大儒
遗传    2013, 35 (7): 923-930.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.00923
摘要619)      PDF (419KB)(2570)   
氯吡格雷是一种广泛用于预防静脉血栓形成的抗血小板药物。研究表明, 携带有CYP2C19基因功能缺失型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3的病人, 其体内代谢氯吡格雷成为其活性形式的能力降低, 导致氯吡格雷抑制血小板聚集功能减弱。文章旨在建立一种利用高分辨率熔解曲线分析(High-resolution melting curve analysis,HRM)技术在闭合单管中同时对CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点进行简便、准确分型的方法。本实验针对两个SNP位点分别设计特异性的HRM引物, 并在两个位点引物的5′端分别加上富含AT和GC的序列, 保证两个位点的扩增产物熔解峰无重叠。利用HRM技术, 快速、灵敏地对64例随机DNA样本的CYP2C19*2 、CYP2C19*3两个多态性位点进行了基因分型, 且HRM方法的分型结果与测序验证结果完全一致。因此, 利用HRM技术可以实现在闭合单管中简便、准确地对CYP2C19*2 、CYP2C19*3两个多态性位点同时进行基因分型。该方法有望应用于临床, 指导氯吡格雷的个体化用药。
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心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估
彭夕洋 陈婷芳 黄婷 江志钢 吴秀山 邓云
遗传    2013, 35 (4): 511-518.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.00511
摘要997)      PDF (521KB)(2170)   
本课题组前期研究中, 利用斑马鱼cmlc2 (Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系, 并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明, 在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中, 绿色荧光信号在心脏中特异表达, 该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同; 该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常; 进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明:该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型, 研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。
被引次数: Baidu(7)
植物中瞬时表达外源基因的新型侵染技术
杨丽萍,金太成,徐洪伟,李华,周晓馥
遗传    2013, 35 (1): 111-117.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.00111
摘要729)      PDF (412KB)(1774)   
由于瞬时表达系统的局限性使其不利于规模化生产的应用, 本文介绍了一种新型的瞬时表达侵染技术—种子吸收法在植物中进行外源蛋白的表达。利用种子自然吸收来源于TMV病毒载体的农杆菌重悬液在番茄中成功的表达了报告基因GFP, 并优化了影响基因表达的各种因素, 包括菌液重悬液浓度和其他侵染条件。与其它侵染方法相比, 该方法具有独特优势, 如操作过程简便, 有利于外源蛋白的规模化生产, 并能够进一步扩大植物生物反应器的宿主范围。我们推测种子吸收法将有利于重组药用蛋白在植物中的工业规模化生产。
被引次数: Baidu(16)
Tm-shift基因分型方法在遗传学中的应用
袁芳,徐进,季林丹,费丽娟,刘盼盼,张莉娜
遗传    2012, 34 (11): 1484-1490.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01484
摘要1087)      PDF (494KB)(1664)   
Melting Temperature shift(Tm-shift)是一种新的基因分型方法, 主要通过在两条特异性引物5′端加入不同长度的GC序列, PCR扩增后根据熔解曲线中产物Tm值的差异来完成分型。文章建立了Tm-shift法对2 048份样品的29个SNP进行分型, 通过分型成功率、重复检测一致率、测序验证准确度综合评价分型效果。结果显示, 29个SNP中有27个可以采用本方法分型, 分型成功率为93.1%。测序验证准确性达到100%。3种基因型阳性标准对照重复检测一致率为100%; 100个随机样品重复检测, 重复性为97%。因此, Tm-shift基因分型法是一种成本低廉、准确灵敏、稳定可靠、通量灵活、操作简便的基因分型方法, 可在遗传学研究中推广应用。
被引次数: Baidu(12)
植物LTR类反转录转座子序列分析识别方法
侯小改,张曦,郭大龙
遗传    2012, 34 (11): 1491-1500.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01491
摘要1143)      PDF (437KB)(4416)   
LTR类反转录转座子(Long terminal repeat retrotransponson)是真核生物中的一类重要转座元件, 具有分布广泛、异质性高等特点, 在真核生物基因组进化中起着重要作用, 现广泛应用于植物的基因功能分析和遗传多样性研究等方面。LTR类反转录转座子的序列识别是其应用的前提条件, 因此对LTR类反转录转座子的序列鉴定和分析方法的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。LTR类反转录转座子序列的生物信息学分析软件按原理可大致分为序列比对分析和相关序列保守区域识别鉴定两类。比对软件如BLAST、DNAstar等, 是一种序列相似性搜索程序, 通过与已知的反转录转座子序列比对后的序列相似性来判断未知序列是否是反转录转座子序列, 但这类软件不能直接获得具体的LTR等特征序列的相关信息, 不能对反转录转座子序列的全长进行识别。识别鉴定软件按原理可分为从头算起法、比较基因组法、同源搜索法和结构基础法4种, 如LTR-Finder等基于从头算起法的识别鉴定软件, 可对LTR类反转录转座子全序列进行较准确地预测和注释, RepeatMasker等基于同源搜索法的软件, 通过与数据库中的序列的相似性比对后发现可能存在的LTR类反转录转座子。文章对不同的LTR类反转录转座子预测方法进行了比较和分析, 在此基础上归纳总结出一套分析LTR类反转录转座子序列的操作流程, 旨在为LTR类反转录转座子序列的分析提供参考。
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应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA的动态表达
杨红波,梁巍,刘新星,朱作言,林硕,张博
遗传    2012, 34 (9): 1181-1192.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01181
摘要1245)      PDF (700KB)(2304)   
microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA, 主要通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译, 在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA的功能跟它的表达位置与时间密切相关, 但是目前尚缺乏一个能够在活体与个体水平稳定、持续地实时观察miRNA动态表达的方法。文章以斑马鱼为模式, 建立了一个双荧光报告系统(我们称之为miRNA Tracer), 用于在斑马鱼整体胚胎中追踪特定miRNA的表达谱及动态变化过程。该系统以Tol2转座子为基础, 采用来自斑马鱼hsp70基因的热激启动子分别驱动eGFPmRFP1荧光报告基因, 同时在其中一个报告基因的3′-UTR区连接待测miRNA的互补序列, 构成Tracer质粒。该互补序列与斑马鱼胚胎中相应的内源miRNA结合后能够使对应报告基因的荧光信号强度减弱, 通过比较两个报告基因在表达谱上的差异辨别miRNA的表达区域, 检测斑马鱼胚胎中miRNA起作用的位置和时间。文章选择在肌肉系统特异表达的miR-206以及在神经系统特异表达的miR-219, 分别在显微注射瞬时表达和转基因稳定整合等两个层次上验证了上述Tracer系统。结果表明, 所用的方法能够如实地在单细胞水平和整体水平检测到目标miRNA的时空表达动态变化。miRNA Tracer系统为在斑马鱼发育过程中对miRNA进行活体、实时的时空定位提供了一个独特而有效的方法, 也为对miRNA进行功能与作用机制等更深入的研究奠定了基础。 

补充资料

s219mRFP1-dF转基因胚胎的3-D图像
[视频]
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成年斑马鱼OKR行为学分析
黄玉斌,邹苏琪,殷梧,王昆,王晗,胡兵
遗传    2012, 34 (9): 1193-1201.   DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01193
摘要1448)      PDF (568KB)(2080)   
作为视功能检测和与视觉有关突变体筛选的方法, 眼动(Optokinetic response, OKR)和视动(Optomoter response, OMR)行为学是简单有效的视功能检测手段, 广泛用于幼年斑马鱼研究中, 而成年斑马鱼OKR的分析方法却很少有报道。文章介绍了成年斑马鱼眼动反应诱导方式, 以及使用模板匹配(Pattern match)的方法程序跟踪眼部运动, 实现了成年斑马鱼OKR的定量分析。使用该方法, 检测到斑马鱼双眼视觉区对OKR行为的产生具有一定的贡献作用, 并且成年斑马鱼单眼对运动光栅表现出一定的方向敏感性。同样的方法也可适用于幼年斑马鱼的OKR行为学分析。利用此方法初步检测到了钟基因period1b突变体幼鱼的OKR异常。
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