十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种维管束致病菌,能够引起寄主的黑腐病,是研究植物病原细菌与植物互作的一种重要模式菌株。在Xcc中,GntR家族的全局性转录调控因子HpaR1参与调控Xcc的运动、胞外多糖和胞外酶的合成等许多细胞过程,并与Xcc的过敏反应(hypersensitive response, HR)和致病相关;全局性转录调控因子Clp则参与调控胞外酶和胞外多糖的分泌与合成,并与黄单胞菌的致病相关。前期研究发现,Xcc中的转录调控因子HpaR1和Clp均能与糖苷水解酶(glycoside hydrolase)编码基因(命名为ghy基因)的启动子区结合。为探究转录调控因子HpaR1和Clp共同调控ghy基因表达的分子机理,本研究首先通过凝胶阻滞分析(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)发现HpaR1和Clp在体外能够结合在ghy基因的启动子区;利用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法,进一步证实HpaR1和Clp在细胞内能够结合在ghy基因启动子区。通过5ʹ-cDNA末端快速扩增(rapid amplication of 5ʹ-cDNA ends, 5ʹ- RACE)和DNase I保护实验(DNase I footprinting)确定HpaR1和Clp均结合在ghy基因启动子的-35区上游,并且HpaR1的结合位点位于Clp结合位点的上游。通过实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)和体外转录的方法,发现HpaR1抑制ghy基因的转录,而Clp激活ghy基因的转录。当二者共同存在时,HpaR1能够抑制Clp对ghy基因的转录激活作用。HpaR1和Clp单独存在时,分别负调控和正调控ghy基因的转录,推测HpaR1尽管位于ghy基因启动子-35区上游,但可能通过抑制RNA聚合酶的活性来调控ghy基因的表达。

植物脱落酸不敏感蛋白5 (abscisic acid-insensitive 5, ABI5)是种子中大量表达的碱性亮氨酸拉链类型(basic leucine zipper, bZIP)转录因子,在调节种子萌发和幼苗早期生长的脱落酸(abscisic acid, ABA)信号中起着核心作用。油菜素内酯(brassinosteroid, BR)是一种新型植物内源激素,具有调节植物生长发育和逆境胁迫响应等诸多生理功能。近期研究发现,油菜素内酯胁迫条件下,BR信号通路中BIN2 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE2)和BES1 (BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1)通过抑制ABI5表达,促进拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子萌发。为进一步探究BR胁迫下ABI5功能,本研究分析了种子萌发期ABI5表达特性,鉴定出拟南芥ABI5基因缺失突变体abi5-1并对BR胁迫下其功能进行解析。结果表明：ABI5在拟南芥干种子中大量表达并响应萌发期BR胁迫;正常条件下,abi5-1与野生型幼苗下胚轴无明显差异;BR胁迫下,abi5-1幼苗下胚轴明显长于野生型。本研究结果揭示了ABI5调控BR胁迫下拟南芥下胚轴生长,为深入了解ABI5调节植物发育的分子机制提供了依据。

根据文献报道并通过circBase数据库查找,发现小鼠生长激素受体基因(growth hormone receptor, GHR)存在8个环状转录本。为确定GHR基因环状转录本(circGHR)的真实存在,探究其表达规律,本研究以昆明小鼠(Mus musculus)为研究对象,通过PCR扩增和测序检测circGHR的真实存在,并筛选出一个circGHR作为目标分子,通过RNase R处理和反转录证实了circGHR的环形结构,利用qRT-PCR分析circGHR和GHR mRNA的时空表达规律。结果表明：小鼠circGHR全长为820 nt,由GHR基因外显子2~8环化形成。RNase R耐受性分析表明,小鼠circGHR具备环形分子的一般特征,不易被RNase R降解。与oligo-d(T)18引物相比,随机引物对circGHR具有较高的反转录效率,进一步说明circGHR是一个不含poly(A)的环状结构分子。组织表达谱结果表明,circGHR在1周龄和7周龄小鼠肝脏和肾脏高表达,在胸肌和腿肌中低表达;circGHR在肝脏和胸肌组织的时序表达谱结果表明circGHR表达无显著差异;circGHR在腿肌组织的时序表达谱结果表明,circGHR在小鼠5周龄之前为低表达,在7周龄以后表现为高表达。本研究结果证实了小鼠GHR基因存在一个环状转录本circGHR,并初步揭示了circGHR的表达规律,为后期深入开展小鼠circGHR的生物学功能及其在小鼠生长发育过程中的作用机制奠定基础。

样本的族群来源推断在法医调查中可发挥重要作用,一个理想的推断体系是用一组较少的遗传标记实现较高的族群推断准确性。本研究调研搜集了区分东亚北方三个族群北方汉族、日本人和韩国人的428个祖先信息SNP (ancestry informative SNP, AISNP),获取了其在三个族群307份样本中的分型,通过位点Fst值及等位基因频率聚类等信息进一步精简位点,最终得到了一组49AISNP组合。基于307份样本利用留一法对49AISNP进行推断准确性验证,结果表明其在北方汉族、日本和韩国族群中的推断准确性均高于99%。49AISNP组合将有助于东亚地区亚族群的进一步区分。

CTCF (CCCTC-binding factor)是一种重要的染色质架构蛋白,其与绝缘子的方向性结合在哺乳动物基因组三维空间结构形成和维持中起着至关重要的作用。正向-反向相对方向的CTCF结合位点(简称CTCF位点)可以在染色质黏连蛋白(cohesin)的协助下,形成染色质环,介导远距离DNA元件之间的相互作用;而在染色质拓扑结构域边界区域的CTCF位点呈现反向-正向相背方向分布,发挥绝缘子的功能。为进一步研究CTCF介导染色质环的形成与其绝缘功能之间的关系,本研究采用DNA片段编辑方法通过设计成对sgRNA (dual sgRNA)构建了一系列HOXD基因簇区域CTCF位点反转的单细胞克隆。定量高分辨率染色质构象捕获实验显示边界区域CTCF位点反转会改变原有的染色质环方向,通过环挤出模型(loop extrusion)形成新的染色质环,引起染色质拓扑结构域边界漂移至新形成的一对反向-正向CTCF位点处。此外,串联排列的CTCF位点可以通过阻碍反方向渗透的黏连蛋白继续滑动发挥绝缘子的功能。RNA-seq实验发现CTCF位点反转引起的局部基因组空间结构变化会进一步影响基因的表达。上述研究表明相邻两个染色质拓扑结构域边界区域的反向-正向CTCF位点可以通过与各自所在拓扑结构域内相向的CTCF位点形成染色质环,阻碍黏连蛋白滑动,该发现为进一步研究CTCF的绝缘功能和其对基因组拓扑结构的影响提供了参考。

三维基因组染色质架构蛋白CTCF (CCCTC-binding factor)能够介导增强子与基因启动子的远距离染色质相互作用,也可以结合调控区域的绝缘子发挥增强子绝缘功能,对发育中的基因表达调控具有重要作用。同源框基因家族(Homeobox gene family, Hox)编码一类控制动物发育的关键转录因子,在发育中主要沿胚胎首尾轴(head-to-tail axis)呈时空线性表达。在哺乳动物中,Hox基因分为HoxA、HoxB、HoxC和HoxD四个基因簇,在中枢神经系统、骨骼和四肢发育中发挥重要功能。HoxD基因簇主要调控四肢发育,受位于其两侧调控域内的增强子调节,沿肢体近远轴(proximal-distal axis)呈时空线性表达。在人类基因组中,HOXD基因簇及其两侧的调控区域分布有串联排列的CTCF结合位点(简称CTCF位点),参与9个HOXD基因的表达调控。本研究以HOXD基因簇为模式基因,探究CTCF对发育基因(developmental genes)转录调控的影响。利用CRISPR DNA片段编辑技术在人HEK293T细胞中获得一系列的串联反向CTCF位点删除的单细胞克隆株。RNA-seq实验揭示CTCF位点删除后HOXD基因表达下降。定量高分辨率染色体构象捕获实验显示,HOXD与上游增强子簇的远距离染色质相互作用增强,与下游增强子簇的远距离染色质相互作用减弱。综上所述,串联反向的CTCF位点通过其绝缘子功能维持上下游增强子簇对HOXD基因簇表达调控的平衡,为探究动物发育过程中Hox基因表达的精准调控机制提供参考。

细胞自噬基因Atg6在细胞自噬过程中发挥重要作用,其功能缺陷影响神经发生。涡虫是研究中枢神经系统(central nervous system, CNS)再生的良好模型,其头部切除后1周就能再生出一个新的头部。因此,研究Atg6基因在涡虫CNS再生中的作用对探究自噬调控神经发生具有重要意义。本研究首次报道了日本三角涡虫(Dugesia japonica) Atg6基因(DjAtg6)的分子特征,并利用RNAi技术研究了其在涡虫CNS再生中作用。结果显示：DjAtg6 cDNA全长1366 bp,编码423个氨基酸。DjATG6含有ATG6/Beclin 1蛋白家族的Coil-Coil结构域和β折叠α螺旋自噬功能结构域。涡虫沿咽前咽后切割后,DjAtg6表达量显著增加,其转录本主要在新再生的脑神经节表达。RNAi-DjAtg6引起涡虫头部再生迟缓、脑神经结构偏小,并下调神经相关基因的表达。此外,本研究还发现,RNAi-DjAtg6不影响涡虫干细胞的增殖,但下调细胞迁移相关基因mmp1和mmp2的表达,且干扰mmp1和mmp2的表达影响涡虫头再生。因此,本研究结果表明,DjAtg6在涡虫CNS再生的组织重构中发挥重要作用,干扰DjAtg6影响涡虫CNS再生可能与细胞迁移有关,其详细的分子机制尚需进行深入研究。

胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是最常见的原发性颅内肿瘤,恶性程度极高,患者预后极差。为了识别GBM预后生物标记物,建立预后模型,本研究通过分析癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库中GBM的表达谱数据,筛选出不同生存期GBM患者差异基因。利用GISTIC软件和Kaplan-Meier (KM)生存分析方法分析TCGA数据库中的GBM拷贝数变异数据,识别影响生存的扩增基因(survival-associated amplified gene, SAG)。取短生存期组上调基因和SAG两者的交集基因,进行单因素Cox回归和迭代Lasso回归筛选重要候选基因并建立预后模型;计算预后评分,根据预后评分中位数将患者分为高风险组和低风险组。用ROC曲线判断模型的优良,KM生存分析高低风险组预后差异,并用GEO、CGGA和Rembrandt数据库3个外部数据集进行验证。多因素Cox回归分析判断预后评分的预后独立性。结果显示,GBM不同生存期差异分析得到上调基因426个,下调基因65个。短生存期组上调基因与SAG交集得到47个基因。经过筛选,最终确定六基因(EN2、PPBP、LRRC61、SEL1L3、CPA4、DDIT4L)预后模型。TCGA实验组和3个外部验证组模型的ROC曲线下面积均大于0.6,甚至达到0.912。KM分析显示高低风险组的预后都存在差异(P<0.05)。在多因素Cox回归分析中,六基因预后评分是GBM患者预后的独立影响因素(P<0.05)。通过一系列分析,本研究确立了六基因(EN2、PPBP、LRRC61、SEL1L3、CPA4、DDIT4L)的GBM预后模型,模型具有很好的预测能力,可作为预测GBM患者的独立预后标志物。

睾丸支持细胞数量是影响精子生成能力的主要因素之一,microRNA (miRNA)参与调控猪未成熟支持细胞的发育过程,然而,大多数被鉴定出的miRNA对支持细胞的作用及其机制尚不明确。基于本课题组前期高内涵筛选结果,本文进一步通过流式细胞术、蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因等方法,研究了miR-191调控猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用机理。结果表明：过表达miR-191显著促进细胞周期由G₁期进入S期和G₂期,细胞增殖能力显著增强,细胞凋亡率显著降低;而抑制表达miR-191则与之相反。双荧光素酶报告基因系统验证miR-191直接靶向BDNF基因3′-UTR。抑制表达BDNF基因促进细胞周期进入S期,并促进细胞增殖而抑制细胞凋亡,与过表达miR-191的作用一致。共转染试验结果显示,BDNF基因可以拮抗miR-191对细胞增殖和凋亡的调控作用。此外,过表达miR-191和抑制表达BDNF基因均可显著促进PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PI3K和AKT的磷酸化水平,且BDNF基因同样拮抗miR-191对PI3K和AKT蛋白的调控作用。本研究结果证实miR-191靶向BDNF基因,通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖且抑制其凋亡,为进一步解析miR-191调控猪精子生成的生物学功能提供了理论基础。

c-Myc基因在食管癌等多种恶性肿瘤中异常高表达,但其参与癌症发生发展机制尚不完全清楚。为探究c-Myc在食管癌发生中的作用,本文成功构建了食管类器官作为研究模型,首先制备表达c-Myc的慢病毒并通过高效侵染方法获得了稳定过表达c-Myc的食管类器官。以正常食管类器官作为对照,使用ImageJ软件分析感染7代后食管类器官的形态,显示食管类器官的上皮形态并未出现异常。随后利用免疫荧光染色实验和CCK8试剂检测食管类器官的细胞增殖状态,结果显示细胞增殖速度也没有显著改变。最后通过实时荧光定量PCR实验(quantitative real-time PCR, qPCR)检测细胞周期、细胞代谢以及常见的在食管癌中高表达基因的表达情况,结果显示相关基因表达均未显著升高。这些结果初步表明在食管中单独过表达c-Myc基因不足以诱导食管上皮细胞癌化。本文建立了食管类器官研究模型,通过高效的慢病毒过表达体系研究了原癌基因c-Myc对食管类器官发育和增殖的潜在影响。这对于食管类器官模拟食管发育和食管癌发生相关研究具有一定参考意义。

脂质是构成生物体的重要成分之一,脂质代谢的精确调节和稳态维持对人类健康至关重要。泛素化途径通过降解脂质相关蛋白来调控脂质代谢。Ppa (partner of paired)编码一种F-box蛋白,后者是SCF (Skp1-Cullin1-F-box)泛素化复合体成员之一。已有的研究表明Ppa在调控果蝇体节的正常发育和着丝粒组蛋白的正确定位方面发挥重要的作用,但在脂肪代谢方面的功能研究却未见报道。本研究以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)作为研究对象,探究了Ppa在脂肪储存中的功能。通过与绿色荧光蛋白融合表达,检测PPA的亚细胞定位;应用CRISPR/Cas9技术,构建Ppa的缺失突变体;通过BODIPY 493/503或Nile red脂滴染色,对缺失突变体和超量表达Ppa果蝇的脂滴形态改变进行分析。随后,在缺失突变体中超量表达Ppa以验证其功能。结果表明,PPA-GFP融合蛋白定位于唾液腺和脂肪体的细胞核中。与对照组果蝇相比,Ppa缺失突变体表现为脂滴变小;超量表达Ppa显示出脂滴变大。在突变体中超量表达Ppa能够将脂滴回复至正常状态。综上所述,本研究揭示了Ppa在果蝇中具有促进脂肪储存的功能。

针对酸性土壤中影响作物生产的主要限制因子(pH及其铝毒),选用耐酸铝且具有固氮能力的豆科作物是改良该类土壤、促进农业生产的有效措施之一,至于其所关联的根际微生物是否起到相应的促进作用,一直为国内外学者所关注和探究。为此,本研究以铝耐受型大豆品种基因型(BX10)和铝敏感型大豆品种基因型(BD2)为材料,以酸性红壤为生长介质,采样部位按照土层到根系的距离由远到近的顺序划分为：根外对照土(bulk soil, BS)、两侧根际土(rhizospheric soil at two sides, SRH)、刷后根际土(rhizospheric soil after brush, BRH)和冲洗后的根际土(rhizospheric soil after wash, WRH)。利用Illumina MiSeq对16S rRNA基因扩增产物的高变区V4进行高通量测序,研究了不同耐铝基因型大豆根际细菌群落的结构、功能与分子遗传多样性的差异性作用。结果表明,各处理间大豆根际细菌群落的alpha多样性无显著性差异,beta多样性差异也均不显著。PCA和PCoA分析可见BRH和WRH部位的物种组成较为一致,而BS和SRH部位具有相似的物种组成,说明植物生长主要影响根际的BRH及WRH部位的微生物,对SRH影响较小。对各分类水平物种组成和丰度进行比较,门分类水平三元图表明两个基因型大豆均在WRH部位富集蓝细菌门(Cyanobacteria)细菌;统计分析表明铝耐受型大豆(BX10)根部对于增强植物抗逆性的植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)有富集作用,这些富集的细菌包括蓝细菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)等,以及部分与固氮和耐铝的功能相关的属种。另对同一个基因型大豆不同采样部位间进行比较分析,结果显示土壤不同采样部位可以选择性富集不同的PGPR物种。此外,16S rDNA的同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)功能预测分析的结果表明,多个COG包括COG0347、COG1348、COG1433、COG2710、COG3870、COG4656、COG5420、COG5456和COG5554均可能与固氮直接相关;BD2相比于BX10,结果显示在BRH和WRH部位似乎均更易富集固氮直接相关的COG,其可能的原因尚待进一步研究。

联合育种的准确性受到群体间遗传关联程度的影响。本研究通过比较基于系谱数据和基因组数据计算的群体遗传关联,探究高密度SNP标记在遗传关联估计中的应用前景。本研究同时使用了模拟数据和真实数据,采用6种不同的遗传关联计算方法,包括PEVD(prediction error variance of differences)、PEVD(x)、VED(variance of estimated difference)、CD(generalized coefficient of determination)、r(prediction error correlation)和CR(connectedness rating),比较基于构建不同的关系矩阵(A、G、G_s、G_0.5和H矩阵)的群体间遗传关联。模拟数据和实际数据结果表明,除PEVD(x)和VED方法外,PEVD、CD、r和CR基于基因组信息的G、G_s和G_0.5阵计算的遗传关联程度均高于基于系谱信息的A阵,基于同时利用系谱和基因组信息的H阵遗传关联结果一般介于A阵与G阵之间。当CR和r为0时,CD都较高,高估了群体遗传关联。用r度量3个遗传分化程度不同的猪场间遗传关联时,基于G阵的r值均为0.01,不能准确反映群体真实遗传关联。随着遗传力的提高,所有群体遗传关联评估方法都有所改善,但遗传力为0.1时,PEVD基于A阵结果优于G阵,中高遗传力性状用于估计遗传关联优于低遗传力性状。本研究证明高密度SNP标记比系谱信息估计群体间遗传关联更有优势,CR是衡量遗传关联稳健而可靠的评价指标,计算简单,受性状遗传力影响较小。PEVD可以作为补充,量化具体群体遗传关联下的育种值预测误差情况。G矩阵比G_s、G_0.5阵能更好反映群体遗传关联。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种能够对人类以及鱼、虾、贝类等水产品致病的弧菌,给人类健康带来威胁,也给水产养殖业造成巨大的经济损失。目前该物种基于全基因组的遗传多样性和重要遗传元件研究报道较少。本研究对采集自全国4个省份的68株溶藻弧菌进行高通量测序,获得全基因组序列,并结合113株公开发表的全球序列数据,利用fineSTRUCTURE软件、VFDB毒力因子库和CARD、ResFinder耐药数据库,对溶藻弧菌的种群结构和毒力、耐药因子分别进行解析。结果表明：溶藻弧菌可分为谱系1和谱系2。两个谱系在美洲和亚洲均有分布,但欧洲仅分离到谱系1菌株;共鉴定发现12个克隆群,其中一个克隆群内菌株存在跨洋传播现象。该物种携带tlh、OmpU、IlpA等多种不同功能的毒力因子;毒力因子在两个谱系间的分布无特异性,但存在地域间差异：其中欧洲菌株携带VP1611、vcrD、vopD和fleR/flrC的比率低于其他地区,而基因IlpA的携带率则明显高于其他地区,我国广西菌株中fleR/flrC基因携带率低于其他省份,且不携带IlpA。多个基因组携带blaCARB-42、tet(34)、tet(35)、parE、CRP、rsmA、TxR和fos等与多种抗生素耐受相关的基因,其中TxR和fos基因在谱系2中的出现频率远高于谱系1;此外,TxR基因在亚洲菌株中的携带率高于美洲和欧洲地区,而在我国四川菌株中的携带率则低于其他省份。在5个基因组中(VA24、VA28、2014V-1011、ZJ-T和Vb1833)观察到质粒或ICE等携带多种耐药基因的大片段。本研究通过群体基因组学的研究方法,揭示了溶藻弧菌的种群结构组成和毒力、耐药相关元件的分布,为进一步了解溶藻弧菌的遗传特征和致病机制提供必要基础,为该病原的监测、预防和控制工作提供科学支撑。

肝功能检测(liver function test, LFTs)指标是受遗传和环境影响的复杂性状,具有个体差异性。为系统性研究中国人群全基因组范围内单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与肝功能指标之间的联系,本研究利用英国生物银行(UK Biobank)中1653名中国人的基因分型数据和表型数据为研究对象,利用PLINK软件进行全关联分析研究(genome-wide association study, GWAS),发现229个SNP与中国人群血液中的总胆红素(total bilirubin, TB)相关,27个SNP与中国人群血液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)相关,36个SNP与中国人群血液中的γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)相关,1个SNP与中国人群血液中的门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase, AST)相关,最显著的位点中有11个位点是新的LFTs关联位点。通过功能基因组分析,发现这些位点的临床意义(如吉尔伯特综合征),确定了候选基因(UGT1A, ABO, GGT1),为从遗传角度理解中国人群LFTs的个体差异性和肝功能指标临床精准检测提供了前期研究基础。

肌生长抑制素(myostatin, MSTN)是转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β)家族成员之一,是一种肌肉生长抑制因子。解除MSTN的生长抑制功能是提高畜禽肌肉产量的一种有效途径。TGF-β的半胱氨酸节结构基元(cystine knot motif) 能够稳定MSTN蛋白结构,对MSTN生物学功能的发挥具有重要调控作用。本研究应用CRISRP/Cas9基因编辑技术在两广小花猪肾细胞(Liang Guang small spotted pig kidney cells, LPKCs)中对MSTN基因外显子3进行编辑,破坏了其半胱氨酸节基元,以解除MSTN对靶基因的抑制功能。将流式分选获得的混合阳性MSTN编辑LPKCs作为供体细胞进行核移植和胚胎移植,获得8头MSTN基因编辑两广小花猪仔猪,其中2头存活至10日龄,经鉴定这2头均为基因编辑杂合子,它们在构成MSNT蛋白半胱氨酸节基元的两个半胱氨残基C106和C108编码序列附近分别发生碱基的缺失与替换,导致移码突变,使C106和C108突变为其他氨基酸。MSTN基因编辑两广小花猪杂合子肩部和臀部肌肉较为发达。H&E切片分析显示,MSTN基因编辑猪肌纤维横截面积显著减少,肌纤维数量显著增多。Western Blot分析结果显示,C106和C108缺失对MSTN蛋白表达无显著性影响,但显著促进其靶基因Myf5、MyoD和Myogenin等成肌相关因子的表达。本研究获得的基因编辑猪模型没有造成MSTN表达完全缺失,可保留MSTN其他生物学功能,在促进两广小花猪肌肉生长的同时还消除了MSTN完全缺失可能对小花猪造成的潜在影响。

类伸展蛋白(Leucine-Rich Repeats Extensins, LRX)是一类细胞壁嵌合蛋白,其N端包含一个LRR (leucine-rich repeats)结构域,C端含Extensins结构域。研究表明,LRX基因家族在拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉萌发和花粉管生长过程中具有重要作用,而水稻(Oryza sativa L.) LRX基因家族是否在调控花粉发育方面具有保守的生物学功能尚不清楚。本研究首先进行了生物信息学分析,结果显示,水稻LRX基因家族包括8个成员,OsPEX3、OsLRX3、OsLRX5位于水稻第1号染色体;OsLRX1、OsLRX3、OsLRX2、OsPEX1和OsPEX2分别位于第2、第5、第6、第11和第12号染色体,其中OsPEX1基因在花粉中高表达,暗示OsPEX1可能参与了花粉发育调控。为此,本研究采用RNAi技术进一步研究了OsPEX1基因对花粉发育的影响。结果表明,OsPEX1基因的RNAi转基因植株花粉败育,结实率仅为10%-30%。qRT-PCR分析显示,这些RNAi转基因植株OsPEX1基因表达量显著低于野生型,而且其表达量越低花粉育性亦随之降低。上述研究结果表明,水稻OsPEX1基因是水稻花粉发育的重要基因,该基因的克隆和功能分析有助于进一步阐明水稻花粉发育调控的分子遗传学机制。

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种儿童时期较为常见的神经肌肉病,属于常染色体隐性遗传。绝大多数SMA由运动神经元存活基因1 (survival motor neuron 1,SMN1)的纯合缺失突变所致。而SMN1的2+0基因型个体作为一种特殊的SMA携带者,给携带者筛查以及家系的遗传咨询带来了巨大的挑战。已有研究表明,g.27134T>G和g.27706_27707delAT多态位点变异对于Ashkenazi犹太人群中的2+0基因型个体具有提示作用。为进一步探究这两个多态位点是否在中国人群也具有特异性,本研究纳入了44例家系成员和204例已知SMN1基因拷贝数的对照样本。44例家系成员来自于9个无关的SMN1基因纯合缺失的SMA家系,先证者双亲之一疑似为2+0基因型携带者。利用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)和短串联重复(short tandem repeat, STR)连锁分析进行基因型的鉴定以及多态位点的筛查,最终通过对家系三代成员或多子女家系两代成员的分析确定了9个家系中的10例个体为2+0基因型携带者,多态位点筛查显示1例携带3拷贝SMN1基因的个体同时存在g.27134T>G和g.27706_27707delAT多态位点的变异。因此,本研究通过对2+0基因型携带者的鉴定,为家系遗传病的诊断提供了精准的遗传咨询。g.27134T>G和g.27706_27707delAT多态位点可能与中国人群2+0基因型个体的关联度较低,尚需寻找中国人群特异的多态位点以提高2+0基因型携带者的检出率。

炎性肠病在全球范围内发生极其普遍,具有反复发作、难以治愈的特点,也是诱发结直肠癌的高风险因素之一。肠炎的发生与遗传因素密切相关,有报道发现位于GPR35基因座上的多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点rs4676410、rs3749171和rs3749172与肠炎敏感性高度相关,但是GPR35基因在肠炎的发生发展进程中的功能及相关机制尚没有明确结论。为了研究GPR35在肠炎中的作用,首先通过CRISPR/Cas9技术构建Gpr35敲除小鼠,随后利用DSS诱导的肠炎模型评价Gpr35在肠炎发生中的作用,发现敲除小鼠在体重变化、DAI评分、肠上皮损伤以及炎性细胞浸润等肠炎相关指标显著低于野生型小鼠。为了研究肠炎相关SNP突变对GPR35活性的影响,首先根据rs3749171和rs3749172SNP位点突变信息构建GPR35-T108M和GPR35-S294R两种突变型受体,其次通过多种GPR35下游信号通路活性测试,发现两种突变均能够增强GPR35受体活性。最后通过Western blotting分析发现相较于野生型小鼠,Gpr35敲除小鼠肠上皮Erk1/2磷酸化水平增加,表明Gpr35敲除后可能通过上调Erk1/2信号通路的方式抑制肠炎的发生发展。综上所述,本研究发现人类肠炎易感的rs3749171和rs3749172位点可能通过激活GPR35及下游信号通路的方式促进肠炎的发生发展,为炎性肠病的治疗提供了潜在的药物作用靶点。

同源重组是生物遗传变异的重要来源。受检测方法限制,高等植物同源重组发生及其产物——异源双链DNA(heteroduplex DNA, hDNA)鲜有报道。本研究采用构建抑制减数后分离群体检测同源重组产物hDNA的方法,以2个母本来源的基于抑制减数后分离获得的毛白杨(Populus tomentosa)杂种三倍体群体为研究材料,利用筛选出的110个简单序列重复(Simple sequence repeat, SSR)分子标记开展毛白杨不同基因型个体间9条染色体上hDNA发生及其遗传变异研究。结果表明,2个毛白杨雌株hDNA发生频率介于8.5%~87.2%之间,且hDNA发生频率与距着丝粒距离呈正相关关系,但同一染色体平均hDNA发生频率与染色体长度无相关关系;绝大多数的染色体检测出1~3次重组事件,少数检测出4次重组事件,极少数检测到5次重组事件;不同毛白杨基因型个体间同一染色体上hDNA发生频率总体相差不大,而在一些特定SSR位点间hDNA发生频率存在较大差异;与青杨杂种‘哲引3号’杨(P. pseudo-simonii×P. nigra ‘Zheyin3#’)相比,检测到的同源重组次数及hDNA发生频率和发生位置均存在较大差异。本研究首次对2个基因型毛白杨同源重组发生特征及其变异进行了研究,为揭示高等植物同源重组特点、种间和种内同源重组差异等提供了重要见解。

18-三体综合征是常见的常染色体非整倍体疾病之一,长期以来人们对18-三体综合征疾病的临床表型(如智力障碍、心脏、肾脏异常等)发生及发展相关的基因调控知之甚少。为探索影响该疾病表型的调控因子,本研究利用单细胞ATAC测序技术,对18-三体综合征和对照组的脐带血单个核细胞的开放性染色质区域的转录因子进行分析。捕获11,611个细胞构建的单细胞文库鉴定得到7种主要免疫细胞群,细胞数量统计的结果提示18-三体综合征的免疫系统异常。通过分析开放性染色质区域,筛选得到14个转录因子(P<0.05,|FC|>1.2)。采用实时荧光定量PCR验证其中4个转录因子(TEAD1、TEAD2、TEAD4、Twist2)的相对表达量的结果符合预期。上述研究结果表明这4个转录因子可能与18-三体综合征患者心脏和骨骼发育的异常相关,为18-三体综合征表型的发生及发展的机制研究提供候选分子。

作为一种常见的表观遗传修饰类型,DNA甲基化对哺乳动物发育起着重要作用。Uhrf1作为重要的表观遗传调控因子,在DNA合成过程中可结合半甲基化的DNA同时招募DNA甲基转移酶1参与DNA甲基化的维持,保证遗传信息在细胞分裂前后的稳定传递。目前关于Uhrf1介导的DNA甲基化是否影响肠上皮发育过程尚不清楚。为探索Uhrf1在肠上皮发育中的作用,本研究成功构建了肠上皮特异性敲除Uhrf1的小鼠模型,利用HE染色对肠上皮组织形态学观察发现,与正常小鼠相比,敲除Uhrf1的小鼠肠上皮发育异常,主要表现为绒毛变短,数量减少,隐窝萎缩;通过表型分析发现,在小鼠肠上皮中特异性敲除Uhrf1后,细胞增殖明显受到抑制、凋亡细胞增加、细胞分化异常,同时肠干细胞相关基因表达降低。进一步对可能的分子机制进行初步探索发现Uhrf1缺失后 DNA甲基化水平大幅下降,诱发DNA损伤。本研究结果表明Uhrf1介导的DNA甲基化对肠上皮的正常发育成熟具有重要作用,有望丰富Uhrf1介导的DNA甲基化在体内的生物学功能,并为进一步明确Uhrf1介导的表观遗传调控机制提供实验依据。

钾离子通道在心肌细胞动作电位复极过程中起着重要作用。钾离子通道蛋白种类繁多,已知钾离子通道蛋白KCNQ和HERG/eag参与心脏动作电位的形成,调节心脏收缩节律。钾离子通道蛋白Shaker是果蝇(Drosophila)体内发现的第一个电压门控钾离子通道,维持神经元和肌肉细胞的电兴奋性,但是目前其在成人心脏功能中的作用仍不清楚。本研究以果蝇为模型,高频电刺激模拟心脏应激状态,观察钾离子通道蛋白shaker基因突变体的心衰发生率。同时,利用心脏特异性启动子hand4.2 Gal4特异性敲低钾离子通道蛋白Shaker的表达;果蝇成体心脏生理学功能分析系统分析了1、3、5周龄特异性敲低钾离子通道蛋白Shaker的心脏表型。结果表明,shaker基因突变将严重影响果蝇心脏抗应激能力,表现在高频电刺激后的心力衰竭发生率显著性升高;心脏特异性敲低shaker基因导致5周龄果蝇心律失常发生率显著性增加;心脏特异性敲低HDAC3将显著降低果蝇寿命。综上所述,本研究推测钾离子通道蛋白Shaker在衰老过程中维护果蝇正常的心脏功能。

纳米物质以其独特的物理性质广泛用于化妆品、医药和食品工业,但它们的安全性和遗传毒性仍然存在争议。本研究拟采用基于人成淋巴TK6细胞的体外彗星实验整合体外PIG-A基因突变实验对纳米银颗粒(AgNPs)和纳米二氧化钛颗粒(TiO₂NPs)的致DNA断裂作用和致突变性进行初步研究。本研究探究了最高至200 μmol/L浓度时,TK6细胞暴露于两种纳米物质4 h时的彗星实验和经过暴露24 h以及10 d基因突变表达期后的PIG-A基因突变结果。同时,本研究还检测了TK6细胞暴露于纳米颗粒4 h及24 h对纳米物质的摄取能力。在纳米物质摄取实验中,随着纳米物质浓度的升高,TK6细胞在流式细胞仪检测图中的侧向散射角(side scatter, SSC)呈现浓度与时间依赖性升高,表明TK6细胞可摄取两种纳米颗粒。在4 h彗星实验中,AgNPs可导致彗星尾DNA荧光%强度呈现浓度依赖性显著升高,为阳性结果。而TiO₂NPs则不能诱导彗星尾DNA荧光%强度呈现浓度依赖性显著升高,但最高浓度组尾DNA荧光%超过本实验室阴性历史对照数据,为可疑结果。而在体外PIG-A基因突变实验结果中,AgNPs和TiO₂NPs均不能诱导TK6细胞的PIG-A基因突变率出现阳性升高。AgNPs可导致TK6细胞出现DNA损伤,但不能诱导PIG-A基因突变率升高。TiO₂NPs既不能诱导TK6细胞出现DNA损伤,也不能诱导PIG-A基因突变率升高,TiO₂NPs的遗传毒性有待进一步验证。

果蝇(Drosophila melanogaster)利用天然免疫反应来抵御外源病原菌的入侵,其分子调控机理在进化上非常保守,深入探究果蝇天然免疫调控机制对于人类天然免疫及相关疾病研究具有重要意义。为了发掘参与调控果蝇STING信号依赖的天然免疫反应的新因子,本研究采用双链RNA介导的基因表达沉默技术和双荧光素酶报告系统,在体外S2细胞中对echinus (CG2904)、usp16 (CG4165)、smurf (CG4943)、pellino (CG5212)、usp47 (CG5486)、diap2 (CG8293)、dtraf2 (CG10961)、roquin (CG16807)和usp10 (CG32479)共9个编码泛素连接酶的基因进行双链RNA敲低实验,结果显示CG16807 (roquin)与STING天然免疫信号水平呈现负相关。进一步通过过量表达的方法在S2细胞中过表达roquin能显著抑制STING天然免疫信号。同时,通过李斯特菌感染实验表明,敲低roquin显著提高果蝇感染后抗菌肽的表达,并抑制病原菌的增殖,从而提高果蝇感染后的存活率。本研究证明RNA结合蛋白Roquin是STING依赖的果蝇天然免疫反应的负调控因子,由于果蝇基因和人类基因存在高度相关性,因此本研究为进一步开发人类STING相关的天然免疫疾病治疗方法提供了理论基础。

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用,且NOXA基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究NOXA启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控BCL2基因表达,本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture, 3C)、实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实,NOXA启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控BCL2基因表达。NOXA启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关,在较弱凋亡信号刺激下(1 μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子主要发挥增强子功能;随着凋亡刺激信号的加强(10 μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子活性增强,主要调控其基因自身的表达,促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)证实NOXA启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

生殖细胞的自我更新及分化过程对于男性不育及生殖细胞肿瘤的发生至关重要,CG8005基因作为果蝇(Drosophila melanogaster)睾丸生殖干细胞的调控因子之一,其功能机制尚不清楚。为了探讨CG8005基因在果蝇睾丸生殖细胞中的生物学功能,本研究首先通过UAS-gal4系统介导的RNAi途径,驱动果蝇睾丸生殖细胞和包囊细胞中UAS-CG8005 RNAi的表达,观察后代雄性果蝇的生育能力;其次,通过免疫荧光染色方法检测对照组和CG8005 RNAi雄性果蝇睾丸中Vasa、IBI、锌指结构域1蛋白(Zn finger homeodomain 1, Zfh1)、眼缺陷蛋白(eyes absent, Eya)、DE-cad、FasIII以及磷酸化组蛋白H3 (phospho-histone H3, PH3)、TUNEL等表达模式;最后,使用小干扰RNA (siRNA)在果蝇 S2 细胞中将 CG8005基因表达沉默,用PH3检测对照组和CG8005 siRNA组中果蝇S2细胞增殖能力,TUNEL及流式凋亡检测技术分析果蝇S2细胞凋亡情况;通过荧光定量PCR检测剪接体亚基的mRNA水平,观察剪接体的相对表达量。结果表明,与对照组果蝇比较,在生殖细胞和包囊细胞中缺失CG8005基因,雄性果蝇的生育能力降低甚至完全丧失;另外,nos-gal4驱动UAS-CG8005 RNAi的雄性果蝇中生殖细胞及生殖融合体消失,并且生殖细胞增殖能力减弱,而tj-gal4驱动UAS-CG8005 RNAi的果蝇睾丸中出现生殖细胞样肿瘤;在果蝇S2细胞中敲减CG8005基因导致细胞凋亡增加,增殖受到抑制;CG8005基因在果蝇S2细胞中沉默引起剪接体亚基的信使RNA水平升高。可见,CG8005基因在果蝇睾丸生殖细胞的自我更新与分化过程中必不可少,其缺失可能导致生殖细胞存活受限甚至生殖细胞样肿瘤的形成;并且CG8005基因可参与果蝇S2细胞的增殖和凋亡,对于细胞生命的维持至关重要,同时可竞争性调节剪接体亚基的mRNA水平。

原发性家族性脑钙化症(primary familial brain calcification, PFBC)是慢性进展性的神经系统遗传病,临床症状主要包括运动障碍、认知障碍及精神障碍等,其致病机制尚未完全明确。研究表明SLC20A2是该病最主要的致病基因。由于Slc20a2基因全身性敲除小鼠模型会导致胎儿生长受限,为更好地研究PFBC发病机制,本研究应用CRISPR/Cas9技术构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠模型。首先,针对Slc20a2基因编码区,设计3条靶向exon3的sgRNA (single guide RNA),通过构建质粒、转染细胞、Surveyor assay等实验验证sgRNA的活性。其次,选取活性较高的sgRNA重组包装AAV-Cre病毒,应用立体定位将AAV病毒定点注射于小鼠纹状体。体外实验结果表明设计的3条sgRNA均能够有效地介导Cas9切割靶DNA。细胞免疫荧光实验结果证实AAV-Cre病毒具有Cre重组酶活性。最后,通过小鼠脑部组织免疫组化、TA-克隆、高通量测序及Western blot方法检测Slc20a2基因敲除效率,发现实验组小鼠纹状体组织Slc20a2表达明显降低。本研究成功设计了3条能够敲除Slc20a2的功能sgRNA,并应用CRISPR/Cas9技术成功构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠,为研究PFBC的发病机制提供了有效的动物模型。

滋养层细胞对维持正常胚胎植入、生长发育有重要作用。研究停育胚胎的滋养层细胞的基因表达差异有助于了解胚胎发育停止或不良妊娠结局的发生发展机制。本研究通过对26例正常妊娠、胚胎停育妇女的绒毛组织进行全转录组测序和初步生物信息学分析,发现胚胎停育组存在436个差异基因,其中406个mRNA为显著上调基因,32个mRNA为显著下调基因。基因富集分析显示这些基因显著富集于免疫相关功能、细胞间黏附等方面,如淋巴细胞激活、髓系细胞激活、细胞外基质及胶原连接等,其潜在调控通路富集到补体及凝血级联反应和细胞外基质降解等条目。此外,本研究利用WGCNA共表达分析得到和差异基因存在共表达关系的lncRNA。根据模块功能不同,绘制了两个网络图,可得4个关键基因,分别为VSIG4、C1QC、CD36和SPP1。本研究得到的这些差异基因可作为对胚胎停育具有潜在影响的关键分子,所富集到的条目可为深入了解胚胎发育停止或不良妊娠结局的病因及机制提供理论依据及方向。

多项观察性研究表明,端粒长度缩短与2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)之间存在关联。然而,传统观察性研究结果常受到混杂因素和反向因果关联的影响,端粒长度与T2D是否存在因果关联尚不明确。本研究在中国汉族人群中利用孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)和多基因风险评分(polygenic risk score, PRS)方法探索端粒长度与T2D的因果关系。MR研究选取8个与端粒长度相关的独立遗传变异作为工具变量,利用2632例中国汉族人群T2D全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)数据,检验遗传预测的端粒长度与T2D的关系。利用中国汉族人群GWAS数据,采用PRS分析评价端粒长度PRS与T2D的关系。MR研究共纳入1318例T2D患者和1314例正常对照,逆方差加权、MR-Egger回归、简单中位数和加权中位数法估计的OR值分别为0.78 (95% CI: 0.36~1.68, P = 0.522)、0.23 (95% CI: 0.01~7.64, P = 0.412)、0.60 (95% CI: 0.28~ 1.28, P = 0.185)和0.64 (95% CI: 0.31~1.33, P = 0.233),遗传预测的较长端粒长度与T2D之间不存在关联。PRS分析未发现端粒长度PRS与T2D显著关联的一致结果。本研究采用MR和PRS方法未发现端粒长度与T2D具有因果关联,后续研究中增大样本量有助于得出更可靠的结论。

骨质疏松症是一种典型的多基因复杂疾病,遗传力高达85%,其发病率已跃居常见疾病的第5位。尽管已经鉴定出大量骨质疏松易感SNP,但大多数SNP位点位于基因组非编码区,且功能机制未知。本研究旨在通过生物信息学分析和功能实验探究骨质疏松非编码功能性易感SNP rs4325274的分子调控机制。首先,通过表观注释发现该SNP所在区域处在增强子上,eQTL和Hi-C分析结果发现SNP调控的潜在靶基因是SOX6;然后,利用多种数据库进行Motif预测,并结合GEO数据库中的ChIP-seq数据分析进行了验证,结果发现转录因子HNF1A更倾向于结合SNP rs4325274-G碱基;进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证了该SNP对SOX6基因表达的增强作用;最后,利用shRNA敲低转录因子HNF1A实验,检测靶基因SOX6的表达变化。以上研究结果初步解析了非编码区功能性SNPrs4325274作为增强子远程调控SOX6基因表达的分子机制,为复杂疾病非编码易感SNP的遗传调控研究提供新思路。

同一来源的供体细胞之间存在异质性。许多研究已经表明体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)效率与供体细胞有关。然而,鲜有在单细胞水平分析供体细胞异质性对核移植效率的潜在影响。本研究利用单细胞转录组测序技术对同一来源且随机挑选的52个猪耳组织成纤维细胞进行测序分析。结果表明有48个单细胞的基因表达模式相似,4个单细胞(编号为D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2)的基因表达模式与其他单细胞存在较大的差异,并且不存在基因表达模式完全相同的两个单细胞。以基因表达模式相似的48个单细胞作为对照,进一步分析了单细胞D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2的差异基因表达模式：首先利用R语言筛选4个单细胞的差异表达基因,并对前50差异表达基因进行汇总;然后对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。富集分析发现差异表达基因的主要分子功能包括能量代谢、蛋白质代谢和细胞对刺激的反应等;主要通路包括KEGG中富集的与细胞周期、细胞代谢、DNA复制相关的通路。根据以上研究结果并结合SCNT研究进展讨论了4个单细胞的差异基因表达模式对核移植胚胎发育效率的潜在影响。本研究揭示了猪耳组织成纤维细胞的转录组异质性,并提供了分析精英供体细胞的一种有效方法,为提高克隆效率带来新的思路。

E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)参与植物的抗逆、生长发育等多种生物途径的调控,其功能研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的报道较多,但在重要经济作物大豆(Glycine max)中鲜有报道。本研究从大豆“南农94-16”中克隆了1个与大豆子叶折叠突变体可能相关的基因Glyma.12G161200,序列分析结果表明该基因编码一个E2泛素结合酶,因此将其命名为GmUBC1。该基因编码区全长为462 bp,编码一个含153个氨基酸的蛋白,预测其分子量为17.25 kDa,等电点为6.74。利用qRT-PCR技术对GmUBC1在大豆不同组织中的表达模式及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式进行分析,发现该基因在开花后40 d种子中表达量最高,在PEG、低温、JA和ABA处理下表达下调。亚细胞定位分析发现GmUBC1蛋白在整个细胞内都有表达。进一步在拟南芥中异源表达GmUBC1,发现转基因株系的千粒重和总氨基酸含量显著提高,表明异源过表达GmUBC1可以调控种子重量和氨基酸含量,为大豆品质改良提供了基因资源。