多项观察性研究表明,端粒长度缩短与2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)之间存在关联。然而,传统观察性研究结果常受到混杂因素和反向因果关联的影响,端粒长度与T2D是否存在因果关联尚不明确。本研究在中国汉族人群中利用孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)和多基因风险评分(polygenic risk score, PRS)方法探索端粒长度与T2D的因果关系。MR研究选取8个与端粒长度相关的独立遗传变异作为工具变量,利用2632例中国汉族人群T2D全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)数据,检验遗传预测的端粒长度与T2D的关系。利用中国汉族人群GWAS数据,采用PRS分析评价端粒长度PRS与T2D的关系。MR研究共纳入1318例T2D患者和1314例正常对照,逆方差加权、MR-Egger回归、简单中位数和加权中位数法估计的OR值分别为0.78 (95% CI: 0.36~1.68, P = 0.522)、0.23 (95% CI: 0.01~7.64, P = 0.412)、0.60 (95% CI: 0.28~ 1.28, P = 0.185)和0.64 (95% CI: 0.31~1.33, P = 0.233),遗传预测的较长端粒长度与T2D之间不存在关联。PRS分析未发现端粒长度PRS与T2D显著关联的一致结果。本研究采用MR和PRS方法未发现端粒长度与T2D具有因果关联,后续研究中增大样本量有助于得出更可靠的结论。

骨质疏松症是一种典型的多基因复杂疾病,遗传力高达85%,其发病率已跃居常见疾病的第5位。尽管已经鉴定出大量骨质疏松易感SNP,但大多数SNP位点位于基因组非编码区,且功能机制未知。本研究旨在通过生物信息学分析和功能实验探究骨质疏松非编码功能性易感SNP rs4325274的分子调控机制。首先,通过表观注释发现该SNP所在区域处在增强子上,eQTL和Hi-C分析结果发现SNP调控的潜在靶基因是SOX6;然后,利用多种数据库进行Motif预测,并结合GEO数据库中的ChIP-seq数据分析进行了验证,结果发现转录因子HNF1A更倾向于结合SNP rs4325274-G碱基;进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证了该SNP对SOX6基因表达的增强作用;最后,利用shRNA敲低转录因子HNF1A实验,检测靶基因SOX6的表达变化。以上研究结果初步解析了非编码区功能性SNPrs4325274作为增强子远程调控SOX6基因表达的分子机制,为复杂疾病非编码易感SNP的遗传调控研究提供新思路。

同一来源的供体细胞之间存在异质性。许多研究已经表明体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)效率与供体细胞有关。然而,鲜有在单细胞水平分析供体细胞异质性对核移植效率的潜在影响。本研究利用单细胞转录组测序技术对同一来源且随机挑选的52个猪耳组织成纤维细胞进行测序分析。结果表明有48个单细胞的基因表达模式相似,4个单细胞(编号为D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2)的基因表达模式与其他单细胞存在较大的差异,并且不存在基因表达模式完全相同的两个单细胞。以基因表达模式相似的48个单细胞作为对照,进一步分析了单细胞D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2的差异基因表达模式：首先利用R语言筛选4个单细胞的差异表达基因,并对前50差异表达基因进行汇总;然后对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。富集分析发现差异表达基因的主要分子功能包括能量代谢、蛋白质代谢和细胞对刺激的反应等;主要通路包括KEGG中富集的与细胞周期、细胞代谢、DNA复制相关的通路。根据以上研究结果并结合SCNT研究进展讨论了4个单细胞的差异基因表达模式对核移植胚胎发育效率的潜在影响。本研究揭示了猪耳组织成纤维细胞的转录组异质性,并提供了分析精英供体细胞的一种有效方法,为提高克隆效率带来新的思路。

E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)参与植物的抗逆、生长发育等多种生物途径的调控,其功能研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的报道较多,但在重要经济作物大豆(Glycine max)中鲜有报道。本研究从大豆“南农94-16”中克隆了1个与大豆子叶折叠突变体可能相关的基因Glyma.12G161200,序列分析结果表明该基因编码一个E2泛素结合酶,因此将其命名为GmUBC1。该基因编码区全长为462 bp,编码一个含153个氨基酸的蛋白,预测其分子量为17.25 kDa,等电点为6.74。利用qRT-PCR技术对GmUBC1在大豆不同组织中的表达模式及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式进行分析,发现该基因在开花后40 d种子中表达量最高,在PEG、低温、JA和ABA处理下表达下调。亚细胞定位分析发现GmUBC1蛋白在整个细胞内都有表达。进一步在拟南芥中异源表达GmUBC1,发现转基因株系的千粒重和总氨基酸含量显著提高,表明异源过表达GmUBC1可以调控种子重量和氨基酸含量,为大豆品质改良提供了基因资源。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一。DNA甲基化的异常是恶性肿瘤的特征之一,并被发现在肝癌等肿瘤的发生发展中发挥重要作用。为了能为肝癌患者提供新的临床预后预测标志物,本研究首先采用整合组学分析策略在全基因组范围内鉴定与肝癌患者预后相关的DNA甲基化驱动的差异表达基因;然后,采用LASSO (least absolute shrinkage and selection operator)分析建立了10个最优基因组合的预后预测模型。Cox比例风险回归分析显示,在校正临床特征参数后,此预测模型高风险评分与患者不良预后显著相关,表明该模型具有潜在的独立预后价值。受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析显示该风险评分模型在预测患者短期和长期预后方面优于其他已被报道的肝癌预后预测模型。基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)表明,高风险评分与细胞周期和DNA损伤修复通路相关。以上结果表明,本研究构建了一个基于10个DNA甲基化驱动基因的预后风险评分模型,该模型可作为肝癌患者的潜在预后生物标志物,有助于肝癌患者的生存预后评估和治疗策略的指导。

基因的表达调控与基因组在细胞核内的三维空间架构相辅相成,原钙粘蛋白(protocadherin, Pcdh)基因簇在大脑发育中起到关键作用,可以作为研究基因表达调控机制的模式基因。转录因子RFX5 (regulatory factor x 5)是翼螺旋家族(winged HLH family)的成员,其蛋白由寡聚化结构域、DNA结合域、螺旋结构域和激活域组成,在调控免疫系统的主要组织相容性复合物II类(major histocompatibility complex class II, MHC II)的表达中起着至关重要的作用。本研究发现RFX5与CTCF在全基因组上结合的位点有部分重叠,利用CRISPR/Cas9 DNA大片段编辑技术,构建了RFX5基因缺失的HEC-1-B细胞系。通过RNA-seq实验,发现RFX5敲除能够显著升高Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2的表达水平。通过ChIP-nexus实验,发现敲除RFX5导致染色质架构蛋白CTCF和cohesin在原钙粘蛋白α基因簇处的结合增加。最后,染色质构象捕获QHR-4C实验发现Pcdhα6、Pcdhα12启动子与远端增强子HS5-1的染色质远距离相互作用增强。上述研究表明RFX5蛋白可能通过调控染色质高级结构影响原钙粘蛋白α基因簇的表达,为未来进一步探索RFX5的功能提供了参考。

长散在核重复序列1 (long interspersed nuclear element-1, LINE-1)是迄今为止发现的人体基因组中唯一具有自主转座活性的逆转录转座子,其转座常引起宿主基因组不稳定,从而导致包括癌症在内的各种严重基因疾病的发生。宿主因子在宿主抗LINE-1转座中发挥着重要作用。宿主因子SLFN14作为免疫系统重要组成员,具有抗病毒活性。本实验室研究发现SLFN14对于LINE-1的转座具有抑制作用。为进一步探究其具体的作用机制,通过对LINE-1复制周期中的转录、翻译、逆转录、整合环节进行实验分析,证实SLFN14能够通过影响LINE-1 mRNA转录过程及其半衰期,降低LINE-1 mRNA的水平,从而影响LINE-1蛋白及cDNA表达水平,最终导致LINE-1复制受阻。同时,通过对SLFN14活性中心的定位,本研究还发现SLFN14的抗LINE-1活性与其核糖核酸内切酶结构域和核糖体结合结构域密切相关。上述研究结果展示了SLFN14调控LINE-1复制的机制,进一步完善了宿主因子调控网络,为控制因LINE-1复制引起的基因组不稳定提供了新思路。

脸部形态是人类重要的生物特征之一,了解脸部形态特征的遗传基础在群体遗传学、发育生物学和法庭科学中具有重要意义。本研究针对中国汉族成年男性人群1177名个体,在高分辨率三维人脸图像的17个脸部特征点中提取出136组欧几里德距离(Euclidean distance)表型。结合3×低深度测序数据,用线性回归分析了125个已报道的与脸部形态显著相关的SNP位点和136组脸部表型之间的相关性。结果表明,在经过多重校正后,来自10个不同基因区域的12个SNP位点与一个或多个脸部特征显著相关(显著性阈值P<1.35×10 ^-3),解释了年龄和BMI指数校正后3.89%脸部表型差异。相关SNP位点包括TEX41 rs17479393,PAX3 rs974448、RAB7A/ACAD9 rs2977562、DCHS2 rs9995821、DCHS2 rs2045323、C5orf50 rs6555969、SUPT3H/RUNX2 rs1852985、MSRA rs11782517、EYA1 rs10504499、GSC rs2224309、DICER1 rs7161418和DHX35 rs2206437。本研究结果对揭示中国汉族人群脸部形态的遗传机制和脸部特征的遗传推断提供了参考数据。

随着测序技术的不断发展,产生了海量的基因组测序数据,极大地丰富了公共遗传数据资源。同时为了应对大量基因组数据的产生,基因组比较和注释算法、工具不断更新,使得联合多种注释工具得到更准确的蛋白编码基因的注释信息成为可能。目前公共数据库的原核生物基因组测序和装配有些是10多年前的,存在大量预测的功能未知的编码基因。为了提升美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中基因组的注释质量,本研究联合使用多种原核基因识别算法/软件和基因表达数据重注释1587个细菌和古细菌基因组。首先,利用Z曲线的33个变量从177个基因组原注释中识别获得3092个被过度注释为蛋白编码基因的序列;其次,通过同源比对为939个基因组中的4447个功能未知的蛋白编码基因注释上具体功能;最后,通过联合采用ZCURVE 3.0和Glimmer 3.02以及Prodigal这3种高精度的、广泛使用且基于算法不同而互补的基因识别软件来寻找漏注释基因。最终,从9个基因组中找到了2003个被漏注释的蛋白编码基因,这些基因属于多个蛋白质直系同源簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)。本研究使用新的工具并结合多组学数据重新注释早期测序的细菌和古细菌基因组,不仅为新测序菌株提供注释方法参考,而且这些重注释后得到的细菌基因序列也会对后续基础研究有所帮助。

藏族为中国西南地区典型的少数民族,分为卫藏、康巴、安多和嘉绒等多个支系。然而,对藏族支系人群的遗传结构,特别是各分支人群的父系、母系遗传结构却缺乏深度解析。本研究基于个体水平的常染色体、父系来源的Y染色体和母系来源的线粒体3个类别遗传信息,对西藏地区卫藏藏族、四川甘孜地区康巴藏族、青海地区安多藏族和四川阿坝地区嘉绒藏族共4个藏族群体进行研究,以揭示其遗传亚结构关系。采用微测序技术检测各位点分型,利用PowerPlex ^?Y23和DNATyper ^TM Y26试剂盒检测Y-STRs基因座分型,通过热图和主成分分析、祖先成分分析、单倍群频率统计、网络图及多维尺度分析等探讨其遗传亚结构。结果表明,常染色体和Y染色体遗传标记可将4个藏族人群分为3类：青藏高原的卫藏藏族为一类,高原周边地区的康巴藏族和安多藏族的遗传结构类似分为一类,“藏彝走廊”中嘉绒藏族的遗传结构与其他藏族人群差异显著而为一类。不同藏族分支人群在线粒体遗传信息方面无明显差异性。上述多类别遗传信息的分析结果为深入了解藏族不同分支人群的遗传亚结构提供了新视角。

癌细胞系模型已广泛用于药物敏感性测试及耐药标志筛选。然而研究者常忽视癌细胞系的基础耐药性,导致许多药效标志物难以应用于临床实践。为评估肿瘤细胞系的基础耐药性水平及其与临床药效的相关性,本研究以48种结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞系为例,通过计算265种药物IC₅₀值之间的相关性系数,以每种CRC 细胞系对上述药物IC₅₀的中值构建可反映基础耐药性水平的评估指标MIC₅₀,并识别出表达值与MIC₅₀显著正相关的基因。然后基于样本内基因表达值的相对大小秩序关系构建临床CRC组织样本的基础耐药评分模型。结果表明：在药物两两间IC₅₀的相关系数中,有99%以上呈显著正相关(FDR < 0.05),证明CRC细胞系存在基础耐药性特征;与MIC₅₀显著相关602个基因,富集到4个与肿瘤耐药密切相关的功能模块。根据5368个MIC₅₀相关基因对,筛选出一个由21个基因对组成的5-FU联合用药评分模型,卡方检验结果表明患者基础耐药性水平的高低与用药后的响应信息显著相关,生存分析显示低分组患者比高分组患者预后更好。本研究结果为CRC联合化疗耐药机制的研究及临床个体化用药提供了一定的理论依据。

人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide, hIAPP)又称胰淀素(Amylin),是胰岛β细胞中胰岛素的共分泌蛋白,与胰岛素共同包裹在囊泡中被分泌出细胞。正常生理条件下,hIAPP有助于胰岛素分泌并调节机体血糖平衡;但其蛋白错误折叠或过量积累则会对细胞造成毒性,进而影响β细胞功能,导致机体罹患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)。为了清除细胞内过度积累的hIAPP,且不影响其正常的合成功能,本研究选用一种新的蛋白质降解技术——Trim-Away,该技术可以在短时间内降解目标蛋白质,且不会对靶蛋白的mRNA转录、翻译等功能产生影响。首先在大鼠(Rattus norvegicus)胰岛素瘤细胞(insulinoma cells, INS1)中过表达hIAPP模拟其过度累积的情况,并通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的释放、CCK8 (cell counting kit-8)的活性以及PI-Annexin V流式检测的阳性比例变化,证明hIAPP的过度积累造成β细胞的凋亡;通过实时定量PCR及ELISA检测发现胰岛素的合成和分泌都受到了阻碍;最后利用Trim-Away技术在hIAPP过表达的INS1细胞中特异性清除了过度积累的hIAPP蛋白。细胞活性实验证实清除hIAPP蛋白可以减少细胞的死亡,ELISA实验证实INS1细胞恢复了胰岛素的分泌能力。本研究验证了hIAPP过度积累对INS1细胞的毒性作用,并且证明Trim-Away技术在清除胰腺β细胞中hIAPP毒性具有效果,为利用Trim-Away治疗糖尿病提供了新的策略。

植物的各项生命活动与其根系微生物组密不可分,且根系微生物组的组成易受到植物生长环境和基因型的影响。为进一步探究中国北方地区种植的不同品种水稻根系微生物组的差异及其相互作用机制,本研究以种植于北京昌平和上庄农场的水稻典型品种日本晴(Nipponbare)和IR24为研究对象,基于16S rRNA基因扩增子测序技术获得根系微生物组序列,利用多样性分析、组成型分析、机器学习的随机森林和网络分析等方法,对旺盛生长期的两种不同品种的水稻根系微生物组进行详细比较。研究发现,种植地点和水稻基因型显著影响了水稻根系微生物组的群落结构,不同基因型导致了根系微生物组在物种分类组成上以及细菌间相互关系的差异,而且根系微生物组能作为生物标记跨地点区分宿主的基因型。本研究结果为深入理解我国北方种植的水稻根系微生物组的组成规律以及从根系微生物与植物互作的角度对品种进行改良提供了数据和理论基础。

新疆近交牛是经45年近亲繁育形成的近交群体,但由于繁育记录缺失,其原始亲本品种未知。为了明确新疆近交牛的遗传背景,并探索利用基因组信息评价牛群近交水平的可行性,本研究利用该群体及荷斯坦牛、新疆褐牛和哈萨克牛等16个国内外牛品种的SNP芯片数据,应用主成分分析和Admixture方法对塔城地区新疆近交牛的群体结构进行分析;通过进一步计算新疆近交牛、荷斯坦牛、新疆褐牛和哈萨克牛的群体遗传学参数以及基因组近交指标评估各群体近交程度;结合新疆近交牛的体型分类和基因组近交指标信息,探讨了个体近交程度与体型表现的关系;最后,基于对新疆近交牛和哈萨克牛高频长纯合片段区域的筛选,鉴定了新疆近交牛基因组特征区域。研究结果显示,新疆近交牛的遗传背景与哈萨克牛基本一致,近交牛基因组纯合程度明显高于其他群体,且基因纯合率越高的近交牛其体型越小,在一定程度上呈现了近交衰退对体型的影响。本研究还鉴定到与新疆近交牛基因组特征区域相关的6个基本生物学通路以及与重要经济性状相关的32个数量基因座(quantitative trait loci, QTL)。本研究结果为新疆近交牛这一特殊遗传资源的育种规划及未来该群体的开发利用提供了科学依据。

近年来的研究发现,一些2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)易感基因位点不仅与T2DM的发病风险有关,还会影响生活方式干预效果。为进一步探究T2DM易感基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点对生活方式干预降低高危人群血糖应答效果的修饰作用,本课题组在德清农村社区开展了生活方式干预试验(2017年6月~12月,对干预组的研究对象进行强化生活方式干预,对照组仅接受常规健康知识宣教),并对研究对象进行SNP基因分型。研究发现,对于rs9502570,干预组中的CC+CT基因型人群的空腹血糖降低值显著高于TT基因型(P=0.031);干预组中CC+CT基因型人群的糖化血红蛋白值降低值为0.03%,TT基因型人群的糖化血红蛋白值升高了0.27% (P=0.012);CC+CT和TT基因型干预组和对照组的空腹血糖和糖化血红蛋白前后差值差之间也有统计学差异(均为P<0.001)。对于rs10811661,干预组中TT基因型人群的空腹血糖降低值显著高于CC+CT基因型(P=0.021);TT和CC+CT基因型干预组和对照组的空腹血糖前后差值差之间亦有统计学差异(P<0.001)。上述研究结果表明,rs9502570、rs10811661两个位点会在一定程度上修饰高危人群对T2DM生活方式干预降低血糖的应答效果,为今后进一步研制糖尿病高危人群个体化干预措施提供了客观依据。

为系统性研究中国人群中抗结核药物引发肝损伤的易感基因标记,本研究以41例抗结核药物引发肝损伤的病人和39例健康对照为研究对象,采用Haloplex捕获测序的方法对其基因组中药物代谢、转运和免疫相关通路的109个基因进行靶向测序。用Plink软件对DNA突变位点与肝损伤的发生进行关联分析,以千人基因组计划东亚人群作为对照组,对显著性位点进行验证,并用SIFT和Polyphen2软件对预测显著关联的位点进行功能预测。结果发现UGT1A4 rs2011404 (χ ² = 4.6809, P =0.0305)是抗结核药物引发的肝损伤的易感基因标记,且rs2011404突变可能引起UGT1A4蛋白的功能障碍。本研究为临床上对抗结核药物的合理用药提供了有益的参考。

人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, tPA)是一种被广泛应用于临床的溶栓药物。双基因共整合入生物体内能够产生协同作用,从而提高目的基因的表达水平。但是目前,利用gGH基因与tPA基因共整合以期提高tPA表达水平的相关研究较少。为筛选获得tPA高表达的tPA/gGH双基因整合的单克隆转基因山羊乳腺上皮细胞株,本研究以β-casein基因作为调控序列,构建乳腺特异性表达载体PCL25/gGH,并通过电转染将tPA和gGH双基因共转染山羊乳腺上皮细胞;通过G418筛选获得抗性细胞株,经PCR检测获得转基因单克隆细胞株;利用催乳素诱导tPA表达,收集48 h后细胞诱导液进行ELISA()和Western blotting检测并分析其tPA表达水平。结果表明,共获得142株抗性单克隆细胞,其中有53株tPA单基因整合细胞株,34株tPA/gGH双基因整合细胞株,双基因整合率达23.9% (34/142)。共检测出29株细胞能够表达tPA,其中单基因表达细胞为12株,表达率为22.6% (12/53);双基因表达细胞为17株,表达率为50.0% (17/34);且单基因细胞表达tPA含量为7.5~52.0 μg/mL,而双基因细胞表达tPA含量为40~360 μg/mL,明显高于单基因表达水平。本研究通过电转染的方式成功获得了tPA/gGH双基因整合的单克隆山羊乳腺上皮细胞株,并证明双基因整合的细胞株表达tPA水平明显提高,为后期制备高表达转基因山羊奠定了基础。

初产母猪断奶后能否正常发情对养猪生产影响重大,也是初产母猪被淘汰的主要原因。本研究以乏情和发情初产母猪为研究对象,首次利用RNA-seq技术对其下丘脑-垂体-卵巢轴中的基因间长链非编码RNAs(long intergenic noncoding RNAs, lincRNAs)进行筛选比较,得到lincRNAs的表达图谱,并对其特征和功能进行了初步分析。结果显示,在乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体-卵巢轴中鉴定得到3519个lincRNAs,以发情组为对照共有17个lincRNAs存在差异表达,其中12个表达上调,5个表达下调(FC≥2, P<0.05)。选择4个差异表达的lincRNAs经qRT-PCR验证,其表达水平与测序结果基本一致。对这17个差异表达的lincRNAs进行GO分析、KEGG通路分析及lincRNA-mRNA共表达网络分析,发现这些lincRNAs主要与猪卵母细胞减数分裂成熟、卵巢细胞分化及颗粒细胞凋亡等生殖活动相关。本研究结果丰富了猪lincRNAs数据资源,为进一步深入研究初产母猪的生殖机能提供了理论依据。

丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK或MKK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联的重要组成部分,在植物的生长发育和胁迫应答过程中发挥重要作用。目前,已在多种植物中鉴定了MKK基因家族,但在十字花科植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)中MKK基因家族的系统鉴定与分析尚未见报道。为了探索小拟南芥MKK基因家族的进化和功能,本研究通过全基因组分析鉴定了小拟南芥中16个MKK基因,散布于小拟南芥的10条染色体上。基于系统发育分析和多重序列比对,将这些基因分为5个亚族：A亚族(5个)、B亚族(2个)、C亚族(4个)、D亚族(3个)和E亚族(2个)。分子进化和共线性分析表明小拟南芥中存在7对复制基因,分别是ApMKK1-1/1-2、ApMKK2-1/2-2、ApMKK3-1/3-2、ApMKK4-1/4-2、ApMKK5-1/5-2、ApMKK9-1/9-2和ApMKK10-1/10-2,其中ApMKK1-1/1-2在复制事件之后发生了加速进化。结合ApMKKs启动子区的顺式元件分布和ApMKKs在成熟叶片、茎、花和果实以及盐胁迫下的表达模式,结果发现复制基因的表达具有组织特异性和功能多样性。部分复制基因在组织中的表达模式存在差异,但在盐胁迫下的表达模式却基本相同。本研究结果为解析MKK介导的小拟南芥发育过程和非生物胁迫信号转导通路的复杂机制奠定了基础。

食管癌是常见的恶性肿瘤之一。由SERPINE1基因编码的纤溶酶原激活物抑制因子1 (plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)已被报道在多种类型癌症患者的肿瘤组织中存在高表达并参与癌症进展。为探讨PAI-1蛋白在食管鳞癌中的作用及其分子机制,本研究首先利用Western blot实验和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测各食管鳞癌细胞系中PAI-1的表达和分泌水平,结果显示,PAI-1高表达的食管鳞癌细胞系分泌至细胞外的PAI-1水平相对较高。进一步选取PAI-1表达及分泌水平均较高的KYSE150和KYSE450细胞系作为研究模型,通过siRNA(小干扰RNA)瞬时转染和Transwell实验证实敲降SERPINE1可显著抑制食管鳞癌KYSE150和KYSE450细胞的侵袭和迁移。同时,构建了慢病毒介导的SERPINE1稳定敲降细胞株KYSE150和KYSE450,将SERPINE1稳定敲降的细胞培养基中外源加入PAI-1蛋白进行 Transwell回复实验,结果表明PAI-1过表达可增强食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力。体内实验结果显示,降低PAI-1表达可显著抑制食管鳞癌细胞的成瘤和肺转移能力。分子水平检测表明PAI-1过表达可激活AKT和ERK信号通路,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)实验结果进一步显示PAI-1可能与膜受体LRP1 (LDL receptor related protein 1)存在相互作用。上述研究结果表明,PAI-1可能通过与LRP1相互作用进而促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移。

使用一组祖源SNP可以分析某人群的遗传成分,推断某个体的族群来源。本课题组前期筛选出74个SNP位点实现了撒哈拉以南的非洲、北非、欧洲、美洲、大洋洲、南亚、西南亚、东亚、东北亚和东南亚等10个地理区域人群的推断,并基于MassARRAY质谱分析技术构建了74-plex SNPs复合检测体系。本研究利用该体系对14个中国人群1371份样本进行基因分型,验证评估该体系对中国人群的区分能力和法医学应用效能。首先,基于全球57个人群3628份个体构建参考人群分型库,采用Structure分析和等位基因频率热图等方法进行人群区分能力评估;然后,选取千人基因组计划中3个人群(不包含在参考人群分型库中)及本实验室检测的14个人群共计1654个体作为测试数据集,通过似然比和族群成分等统计分析,评估该体系对实际样本的族群来源推断能力。结果表明,DNA的量最低为1.5 ng时,74个SNP均可正确判型,适用于微量检材的检测;该体系对全球10个地理区域人群有区分能力,针对测试人群中欧洲、美洲、南部非洲个体族群来源推断的准确率为95.4%、不排除率为1.06%,东亚个体推断的准确率为71.0%、不排除率为17.9%,东南亚个体推断的准确率66.4%、不排除率为 33.3%。该方法可以为实际案件侦察提供线索。

脂肪的过度积累严重危害人类健康。前体脂肪细胞分化是脂肪发育的关键过程,研究前体脂肪细胞分化相关基因的表达有助于认识脂肪沉积的机理。尽管家兔是一种理想的研究脂肪发育的动物模型,但是针对其前体脂肪细胞分化不同时期基因表达谱的研究鲜见报道。本研究通过诱导家兔前体脂肪细胞分化,在分化第0 d、3 d和9 d收集脂肪细胞,利用转录组测序(RNA-seq),在分化第3 d样本与第0 d样本的比较中筛选出1352个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),在分化第9 d样本与第3 d样本的比较中筛选出888个DEGs。GO (gene ontology)功能富集和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析发现,0~3 d分化期上调的DEGs显著富集在PPAR信号通路和PI3K-Akt信号通路上,3~9 d分化期上调的DEGs显著富集到与细胞周期调控有关的GO条目和KEGG信号通路,0~3 d和3~9 d阶段特异上调的DEGs可能分别作用于细胞质和细胞核。通过DEGs的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络分析发现,筛选出的核心节点(hub node)基因可能通过调控细胞周期而影响家兔前体脂肪细胞分化。

表观等位基因一般是指仅由DNA甲基化差异引起的表达量不同的等位基因,对植物形态结构和各种生理过程具有重要影响。但自然条件下环境因素对植物表观等位基因的影响还不清楚,同时表观等位基因在植物环境适应性进化中的作用和机制还亟待探究。为了在全基组水平鉴定拟南芥(Arabidopsis thaliana)中与特定环境因素相关的表观等位基因,并分析它们参与拟南芥环境适应性进化的可能机制,本研究利用623株拟南芥生态型的转录组、甲基化组和种源地气候数据进行多组学关联分析,并同时进行了蛋白互作网络和基因富集分析。以春季和夏季降水量为例,本研究最终鉴定到5个基因(AGL36、AT2G34100、AT4G09360、LSU4和AT5G56910)可能具有相应的表观等位基因,基因内部或附近特定区域不同甲基化水平对它们的表达可能具有调控作用。其中与种子发育有关的印记基因AGL36首次被发现可能作为表观等位基因参与拟南芥环境适应性进化,其他4个基因均与生物胁迫响应有关。自然条件下降水量能影响当地病虫害的严重程度,而DNA甲基化能通过影响这4个免疫基因的表达来影响拟南芥免疫能力。在长期演化过程中有利于个体适应当地降水模式的表观等位基因受到正向选择,这可能是这些表观等位基因参与拟南芥降水适应性进化的潜在机制。通过蛋白互作网络、GO功能分析和KEGG通路分析,本研究还首次发现LSU4可能与LSU基因家族其他成员一样参与硫代谢网络,并通过影响硫代葡萄糖苷代谢参与拟南芥生物胁迫响应。

互花米草(Spartina alterniflora)作为一种海岸带盐生植物,高度耐盐胁迫,但因为缺少参考基因组,其耐盐的分子机制却尚未见报道。NAC家族蛋白是植物特有的转录因子,调控植物的生长发育和胁迫应答。为了鉴定互花米草NAC蛋白(SaNAC)并探究它们与互花米草生长发育及胁迫响应之间的关系,本研究以互花米草三代全长转录组数据为参考,通过与水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和玉米(Zea mays)NAC蛋白序列进行比对,并结合保守功能域进一步筛选,最终找到62个SaNAC蛋白。从蛋白序列比对、进化、motif预测、同源性比较、亚细胞定位、组织表达以及非生物胁迫下的基因差异表达等方面分别对互花米草NAC家族成员进行分析,结果发现SaNAC蛋白均含有保守的NAM结构域,且在进化上与水稻NAC家族具有一定的相似性;SaNAC家族中的两个蛋白SaNAC9和SaNAC49在细胞核表达;另外,本研究还发现互花米草SaNAC基因表达具有高度组织和胁迫应答差异性。这些结果表明互花米草NAC转录因子家族不仅具有保守的功能域,而且在调控互花米草的生长发育和非生物胁迫响应过程中具有重要的作用。

药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知DNA甲基转移酶家族成员DNMT3a不仅能通过促进基因启动子甲基化抑制基因表达,还可通过增强基因内部甲基化上调基因表达。本实验室前期研究发现,将乳腺癌细胞暴露于化疗药物可诱导LINE-1异常高表达,但LINE-1启动子甲基化水平并无显著改变。本研究进一步探讨了在化疗药物压力下DNMT3a是否可通过增强LINE-1基因内部甲基化水平促进LINE-1在乳腺癌细胞中的异常高表达。ChIP实验和甲基分析结果显示,用化疗药物紫杉醇(PTX)处理乳腺癌细胞,不仅可以诱导DNMT3a表达,而且可以促进DNMT3a与LINE-1基因内部区域的结合,提升其基因内部甲基化水平, 进而上调LINE-1的表达水平。利用表达载体增加细胞内DNMT3a的表达水平,可显著上调LINE-1基因内部的甲基化及基因的表达水平,而下调DNMT3a的表达可有效抑制LINE-1表达。上述研究结果表明,DNMT3a介导的基因非启动子区甲基化在药物诱导的LINE-1异常激活中发挥重要作用,为认识LINE-1在乳腺癌化疗耐药性形成过程中异常激活的机制提供了新思路。

酒精滥用不仅导致组织器官损伤,还易诱发神经精神疾病。研究表明,DNA甲基化在酒精诱导基因表达和行为改变中发挥重要作用,但具体的神经生物学机制尚未被阐明。为了探索DNA甲基化在酒精滥用中的作用机制,本研究选取健康成年雄性 SD大鼠(Rattus norvegicus) 32只,随机分为饮水对照组(n=16)和慢性酒精暴露组(n=16),运用双瓶选择实验(two bottle choice test, TBCT)评估大鼠酒精偏爱率(alcohol preference),通过旷场行为(open field test, OFT)评估活动状态并检测血酒精浓度。分离两组大鼠内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex, mPFC),提取总DNA,利用简化代表性重亚硫酸盐测序技术(reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)构建mPFC甲基化谱,对差异基因进行功能富集和通路分析,筛选与酒精滥用密切相关的甲基化差异基因,运用qRT-PCR技术检测差异基因的表达,验证DNA甲基化对基因的表达调控;利用qRT-PCR和Western blot检测甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)和甲基化CpG 位点结合蛋白2 (methyl CpG binding protein 2, MeCP2)的表达;同时,还检测了短期酒精暴露(7 d)对大鼠mPFC内DNMTs和MeCP2的影响(n=8/组)。结果表明,慢性酒精暴露大鼠mPFC内基因启动子区甲基化水平显著升高。与酒精滥用密切相关的差异基因中,慢性酒精暴露组Ntf3和Ppm1G启动子区甲基化水平升高,mRNA表达降低;Hap1和DUSP1启动子区甲基化水平降低,mRNA表达升高。慢性酒精暴露使DNMT3B和MeCP2 mRNA和蛋白表达升高,而短期内酒精暴露不影响它们的表达。本研究初步证实DNA甲基化与酒精滥用的发展相关,可能受DNMT3B和MeCP2分子的调控,并发现了与酒精滥用相关的靶基因Ntf3、Ppm1G、Hap1和DUSP1,为研究酒精滥用的神经生物学机制提供了新见解,同时为酒精滥用治疗提供了可能的药理学靶点。

高等脊椎动物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因编码,催化酪氨酸残基去磷酸化,与其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同调节机体内多种信号通路的信号传导。以往研究表明,SHP2在高等脊椎动物T细胞和B细胞的激活与信号转导过程中起着重要作用。为了研究无颌类脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中与SHP2同源的分子——Lja-SHP2在免疫应答反应中的作用,本研究通过PCR 扩增获取其Lja-SHP2开放阅读框序列,并构建到原核表达载体 pET-32a中,成功在大肠杆菌中实现重组蛋白表达并制备了其兔源多克隆抗体。用混合菌免疫刺激日本七鳃鳗后,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测了Lja-SHP2在日本七鳃鳗免疫相关组织中mRNA和蛋白水平表达谱。结果显示,混合菌免疫刺激后,Lja-SHP2 mRNA和蛋白表达在外周血白细胞和髓样小体中无显著变化,而在鳃组织中显著性上调(P<0.05),说明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要参与了鳃组织的免疫应答反应。为了进一步探究Lja-SHP2与淋巴细胞亚群免疫应答反应的相关性,本研究分别使用B细胞有丝分裂原脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和T细胞的有丝分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin, PHA)免疫刺激日本七鳃鳗。经LPS免疫刺激后,与对照组相比,白细胞中Lja-SHP2蛋白表达显著上调,鳃组织和髓样小体没有显著性差异表达;但经PHA免疫刺激后,与对照组相比,白细胞、鳃组织和髓样小体3种组织中Lja-SHP2均有上调,尤其在白细胞中上调最为显著,大约是对照组的2.5倍,说明Lja-SHP2参与了日本七鳃鳗由PHA介导的免疫应答反应。由于PHA能刺激日本七鳃鳗鳃组织中VLRA ⁺淋巴细胞的活化,这表明Lja-SHP2可能参与了PHA介导的VLRA ⁺淋巴细胞亚群的免疫应答反应。上述研究结果为进一步探索Lja-SHP2在七鳃鳗免疫应答过程中的功能奠定了基础,也为揭示SHP2分子家族的系统发生及探索高等脊椎动物适应性免疫系统的早期发生及其进化历程提供一定的线索。

先天性白内障(congenital cataract, CC)是一种罕见的晶状体发育异常疾病,主要表现为晶状体部分或完全浑浊。先天性白内障遗传异质性高,已鉴定的致病基因多达266个。本研究在一个中国先天性白内障家系中通过全基因组测序及Sanger测序验证,筛查到一个新的先天性白内障候选致病基因TSR1,与家系疾病表型共分离。通过minigene实验证实该变异影响TSR1基因mRNA剪接。Western blotting、免疫荧光和RT-PCR实验证实TSR1在人晶状体上皮细胞SRA01/04、年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组织、24周人胎眼晶状体和小鼠晶状体中表达。通过对iSyTE数据库的分析发现,Tsr1在小鼠的胚胎期和不同发育时期的晶状体中都有表达,且在晶状体特异性CBP:p300双敲除小鼠中Tsr1表达下调。提取在CBP:p300双敲除小鼠晶状体中与Tsr1具有相同表达模式的一组基因进行蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)分析,结果表明筛选出6个基因与Tsr1存在直接相互作用。GO功能分析表明Tsr1参与核糖体的组装,还可能在MAPK-Erk信号通路中发挥作用,为进一步明确Tsr1在晶状体中的功能提供了有价值的研究线索。

利用生物信息学方法分析脱发相关差异表达基因,有望帮助了解脱发发生发展的分子机制。本研究从NCBI的子数据库GEO中选择基因表达谱GSE45512和GSE45513数据集,利用R语言limma工具包,筛选出两个物种斑秃样本与正常样本的共同显著差异表达基因。对这部分基因进行功能注释和蛋白互作网络分析,同时对全部差异表达基因进行基因集富集分析。结果发现,人头皮斑秃样本共筛选出225个差异表达基因;C3H/HeJ小鼠自发斑秃皮肤样本共筛选出337个差异表达基因;两个物种的共同显著差异表达基因有23个。GO功能富集分析和蛋白互作网络分析显示,这部分差异基因显著富集于免疫相关功能,并且彼此间存在蛋白互作关系。基因集富集分析显示两个物种的差异基因都能显著富集到趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用、金葡菌感染及抗原加工与呈递通路;而且人的下调差异基因不仅映射到了人类表型数据库的脱发表型,也映射到皮肤附属物病理相关表型。综上所述,本研究通过生物信息方法分析脱发皮肤组织与正常皮肤组织的差异表达基因,最终筛选出23个在人和小鼠中共同存在的显著差异表达基因;此外,分析发现脱发与免疫过程及皮肤附属物病变密切相关,这些结果为脱发的诊断和治疗提供了新思路。

猪骨骼肌发育是一个复杂的生物学过程,其中骨骼肌卫星细胞分化是影响骨骼肌发育的重要环节。近年来发现长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在骨骼肌卫星细胞分化中具有重要作用。为探究lncRNA TCONS_00815878对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织(心脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和腿肌)及从胚胎期到出生后5个不同时间点(35 d、45 d、55 d胚胎及产后第7 d和第200 d后腿肌肉组织) TCONS_00815878的表达情况;利用反义核苷酸(antisense oligonucleotides, ASO)在猪骨骼肌卫星细胞中敲低TCONS_00815878,检验分化标记基因MyoD、MyoG和MyHC表达情况;通过生物信息学分析预测TCONS_00815878靶基因,并利用DAVID软件在线预测其靶基因的功能与通路。结果表明：TCONS_00815878在猪心肌和腿肌中高表达;仔猪出生后7 d内,TCONS_00815878在猪肌肉组织中表达量不断升高,第7 d达到高峰;在猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中,TCONS_00815878在分化期表达量不断上升,且在分化30 h表达量达到峰值;敲低TCONS_00815878后,MyoD、MyoG和MyHC基因表达量降低,其中MyoD表达量显著下降(P<0.05)。此外,功能预测结果发现,其靶基因富集到糖酵解和丙酮酸代谢等与骨骼肌卫星细胞分化相关的多个生物学过程。本研究推测,lncRNA TCONS_00815878可能对猪骨骼肌卫星细胞的分化起促进作用。

本课题组前期通过高通量测序发现,鸡胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)基因可能存在一个环状转录本。为确定IDE基因环状转录本(circIDE)的真实存在,探究其表达规律,本研究以吉林芦花鸡为研究对象,通过PCR扩增和测序验证了circIDE的真实存在,通过RNase R处理和反转录证实了circIDE的环形结构,通过qRT-PCR分析circIDE和IDE mRNA的时空表达规律,并对比分析了circIDE和线性IDE mRNA在正常体型芦花鸡和GHR突变的矮小体型芦花鸡中的表达差异。结果表明：鸡circIDE全长为1332 nt,由IDE基因外显子2~11环化形成。RNase R耐受性分析表明,鸡circIDE具备环形分子的一般特征,不易被RNase R降解。与oligo-d(T)₁₈引物相比,随机引物对circIDE具有较高的反转录效率,进一步说明circIDE是一个不含poly(A)的环状结构分子。组织表达谱结果表明,circIDE在1周龄和12周龄正常体型芦花鸡肝脏和心脏高表达,在胸肌和腿肌中低表达;circIDE在肝脏组织的时序表达谱结果表明,circIDE在鸡6周龄之前为低表达,在8周龄以后表现为高表达;正常与矮小体型芦花鸡品系间circIDE表达量对比分析表明,正常体型芦花鸡circIDE表达水平高于矮小体型芦花鸡,其中在肝脏组织中差异显著(P<0.05)。本研究证实了鸡IDE基因存在一个环状转录本circIDE,并初步揭示了circIDE的表达规律,circIDE在正常体型和矮小体型芦花鸡肝脏组织中表达量存在差异,本研究结果为深入开展鸡circIDE的生物学功能及其在鸡生长发育过程中的作用机制奠定了基础。

致病性大肠杆菌是引起动物泌尿系统感染的重要病原菌,本研究对泌尿生殖道感染出现潜血的大熊猫尿液中分离的一株致病性大肠杆菌(Escherichia coli CCHTP)进行全基因组测序,检测其中耐药基因和毒力因子的情况,同时对基因岛上耐药和毒力基因及其基因环境进行研究。研究发现,大肠杆菌CCHTP中存在多种类型的耐药基因,其中外排泵系统基因数量最多,包括mdfA、emrE和mdtN等介导多重耐药外排泵的基因。此外,该菌还携带166种毒力因子及563个相关毒力基因,其中属于黏附与侵袭类的毒力因子及相关基因数量最多。对19个基因岛分析发现,基因岛GIs011和GIs017中各有一段包含耐药和毒力基因的序列,两侧与可移动遗传元件(转座酶和插入序列)相连,这些结构可能介导耐药及毒力基因水平转移。本研究通过全基因组测序分析了大熊猫源致病性大肠杆菌中存在的耐药及毒力基因情况,对大熊猫相关疾病的科学治疗、合理用药有重要意义。

基于新抗原的肿瘤免疫治疗,抗原呈递的准确预测是筛选T细胞特异性表位的关键步骤。质谱鉴定的表位数据对建立抗原呈递预测模型具有重要价值。尽管近年来质谱数据的积累持续增加,但是大部分人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型所对应的多肽数量相对较少,无法建立可靠的预测模型。为此,本研究尝试利用迁移学习的方法,先利用混合分型的表位数据建立模型以识别抗原表位的共同特征,在此预训练模型的基础上再利用分型特异性数据建立抗原呈递预测模型Pluto。在相同的验证集上,Pluto的平均0.1%阳性预测值(positive predictive value, PPV)比从头训练的模型高0.078。在外部的质谱数据独立评估上,Pluto的平均0.1% PPV为0.4255,高于从头训练模型(0.3824)和其他主流工具,包括MixMHCpred (0.3369)、NetMHCpan4.0-EL (0.4000)、NetMHCpan4.0-BA (0.3188)和MHCflurry (0.3002)。此外,在免疫原性预测评估上,Pluto相对于其他工具也能找到更多的新抗原。Pluto开源网址：https://github.com/weipenegHU/Pluto。

高油酸花生(Arachishypogaea L.)油具有优异的营养成分和热氧化稳定性,有利于人体健康和工业生产。但是高油酸花生在发芽期间对温度比较敏感,限制了其在低温地区的引种。为了进一步了解高油酸花生在发芽期响应低温胁迫的分子机制,本研究选用田间试验中耐寒表现不同的4种高油酸花生品种,分析其在发芽期低温胁迫下的全基因组水平调控。通过转录组高通量测序共获得139 429条Unigene,其中两组耐寒与不耐寒高油酸花生品种在低温胁迫下共产生差异表达基因(differentially expressed gene, DEG) 3520个,且耐寒花生中上调表达的DEG数目大于下调表达的数目。GO分析表明,耐寒高油酸花生中有关细胞膜代谢与完整性以及细胞外周蛋白差异表达基因的数量较多;KEGG通路分析表明,植物病原相互作用和植物激素信号转导通路在抗寒中起着重要作用。进一步筛选出4个低温诱导蛋白基因——时钟调控蛋白基因(TIC) 、AGO4蛋白基因(AGO4)、组蛋白-赖氨酸N甲基类转移酶ATX3基因(ATX3)、FERONIA类受体蛋白激酶基因(FER)和3个转录因子基因——bHLH、3R-1MYB和EREB,采用qRT-PCR检测这些基因在低温胁迫下的表达量。结果显示,在低温处理3 h后TIC、ATX3和AGO4以及转录因子基因bHLH、MYB和EREB的表达量明显升高,FER在胁迫12 h后也有明显升高,表明这些基因在花生萌发期响应低温胁迫。本研究为深入了解高油酸花生发芽期低温胁迫转录调控机制和筛选花生抗寒基因提供了数据资源。

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase1 (HPRT1)基因突变会导致次黄嘌呤和鸟嘌呤代谢异常,严重的代谢障碍被称为Lesch-Nyhan综合征,表现为智力低下,行为上出现强迫性自我毁伤,并伴随痛风或肾结石等症状。HPRT1基因具有多种突变模式,近年来对其突变谱的研究表明该基因具有一些“突变热点”。本研究选取了导致翻译提前终止的热点突变c.508C>T突变和c.151C>T突变,在HEK293T和HeLa细胞中,以单链寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)作为同源重组模板,利用CRISPR/Cas9技术构建了这两种突变的单克隆细胞株,发生定点突变的效率分别为16.3%和10%。进一步通过Western blot检测点突变的单克隆细胞的HPRT1蛋白表达水平,通过6-TG毒性实验检测点突变的单克隆细胞的次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性,结果表明纯合突变的单细胞克隆不能正常表达HPRT1蛋白,其次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性丧失;杂合突变的单细胞克隆的HPRT1蛋白表达量降低,仍具有部分次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性。HPRT1基因定点突变细胞模型的建立可为今后建立其他HPRT1基因突变的细胞系或动物模型提供借鉴,为研究Lesch-Nyhan致病机制提供基础。

转录因子SOX2 (sex determining region Y-box2)在早期胚胎发育第一次谱系分化以及内细胞团多能性维持等方面具有重要的作用。但是目前有关SOX2基因启动子的系统研究较少,尤其是在猪(Sus scrofa)中尚无相关报道。为系统分析猪SOX2基因启动子在早期胚胎中的活性,本研究通过优化显微注射体系中绿色荧光蛋白表达载体种类和注射时间,构建了适合猪SOX2基因启动子活性分析的参照体系和显微注射体系;对猪SOX2基因翻译起始位点上游5000 bp区域进行转录因子结合位点的预测,发现该区域存在4个转录因子结合位点簇;针对上述区域设计并构建相应的缺失型SOX2基因启动子报告载体,利用建立的显微注射体系将其导入胚胎,通过mCherry荧光强度以及qRT-PCR定量分析SOX2基因启动子中不同转录因子结合位点簇对启动子活性的影响。结果表明,与全长SOX2基因启动子相比,SOX2基因翻译起始位点上游2254~2442 bp区域缺失后,猪4-细胞和8-细胞胚胎中SOX2基因启动子活性下降至17.8%,该缺失区域中仅包含两个NF-AT(nuclear factor of activated T cells)转录因子结合位点。因此,本研究结果推测猪SOX2基因启动子中NF-AT转录因子结合位点是影响猪早期胚胎SOX2基因启动子活性的关键位点。本研究为揭示猪早期胚胎发育中SOX2基因表达调控机制提供了数据支持。

近年来,随着生长性状和饲料转化率的提高,中国地方品种肉鸡腹脂率不断增加,大大降低了肉鸡的品质。过多的腹脂沉积不仅降低了肉鸡的屠宰率和抗病力,而且由于脂肪较难处理,导致其被随意丢弃,污染环境。为了挖掘与中国地方品种肉鸡腹脂沉积相关的基因和调控通路,本研究对杏花鸡分别进行高脂和普通饲料的喂养,检测腹脂沉积情况,并利用转录组测序检测高脂饲养对肝脏和腹脂组织中基因表达的影响。结果表明,喂养两周后高脂组肉鸡腹脂重和腹脂率显著增加,且腹脂细胞的直径和面积也显著增大。对两组鸡的腹脂和肝脏进行转录组测序,发现在腹脂中显著差异表达基因主要富集于细胞周期通路、PPAR (peroxisome proliferator- activated receptor)信号通路和ECM (extracellular matrix)受体信号通路中;而在肝脏中,显著差异表达基因同样显著富集于细胞周期通路中,同时也显著富集于类固醇生物合成和PPAR信号通路中。通过分析腹脂和肝脏组织中共同差异表达的基因,发现这些基因同样显著富集于细胞周期中。进一步以鸡肝癌细胞系LMH (chicken hepatoma cell)细胞和鸡前脂肪细胞系ICP (immortalized chicken preadipocytes)细胞进行体外验证,利用高脂培养基和普通培养基进行培养,结果发现48 h后,高脂培养基可显著促进细胞周期进程,增加处于S期的细胞数。同时,qRT-PCR结果发现高脂培养基可显著促进细胞周期相关基因的表达。综上所述,本研究通过基因表达差异分析,发现高脂饲养可能通过激活鸡脂肪组织的细胞周期来促进前脂肪细胞增殖,进而增加腹脂沉积。该研究结果为进一步了解优质肉鸡腹脂沉积的机制提供了理论依据。

先天性缺指/缺趾畸形表现为手足指/趾骨发育不全等症状,会严重影响患者生活中的精细操作及心理健康。本研究对一个患有先天性缺指/缺趾畸形家系进行了基因变异检测,分析总结了该疾病分型与基因变异之间的关联关系,并探讨了对此类疾病患者开展遗传咨询及基因诊断的策略。首先,采用临床体检及四肢X线检查的方式,对患者表型进行分析。然后,应用D10S1709、D10S192、D10S597、D10S1693和D10S587等5个位点对外周血DNA进行了单倍型分析,并利用Array-CGH检测基因重复片段。最后,通过基于家系调查和基因分析探讨先天性手足裂畸形的致病原因。研究结果显示,先证者为典型的先天性手足裂畸形,表现为双侧食、中指缺失,拇指短,左手无名指畸形与缺失中指的皮肤相连成蹼状;双足正中裂开至足中部,第2和3趾缺失,第4和5趾融合。家系中其他患者表型变异较大。其外周血基因单倍型分析表现为染色体10q24.31-10q24.32区域有一个至少610 kb的重复,Array-CGH分析结果为10q24.31(102 832 650~103 511 083)×3。对先证者及其弟弟和父母进行单倍型分析,确认该家系的致病基因为10q24.31-10q24.32基因重复,单倍型165-251-289-219-102为该病的等位基因。研究结果提示,该家系缺指/缺趾畸形乃由于染色体10q24.31 (102 832 650~103 511 083)×3引起,其单倍型165-251-289-219-102可作为检测10q24.31-10q24.32等位基因的疾病标 志物。